Genomlarda (TILLING) küçük tahıl bitkilerinin etil methanesulfonate Mutagenezinde kaynaklı lokal lezyonların hedeflemesinin geliştirilmesi
Summary
Açıklanan bir mutajen olarak etil methanesulfonate (EMS) kullanımı ile küçük tahıl bitkileri nüfus (TILLING) nüfusun hedefleme kaynaklı yerel lezyonlar geliştirmek için bir protokoldür. Ayrıca sağlanan cel-1 tahlil kullanarak mutasyon algılama için bir protokoldür.
Abstract
Genomlarda indüklenen yerel lezyonlar hedefleme (Tilling) kimyasal mutagenez ve hedef genlerde sıra varyasyonu tespiti içeren güçlü bir ters genetik araçtır. TILLING, özellikle dönüşüm tabanlı yaklaşımların ciddi sınırlamalar tutacağı küçük tahıllarda gen doğrulama için son derece değerli işlevsel bir genomik aracıdır. Sağlam bir mutajize nüfus geliştirmek, bir TILLING bazlı gen doğrulama çalışmasının verimliliğini belirlemenin anahtarıdır. Düşük bir genel mutasyon frekansına sahip bir toprak popülasyon, istenilen mutasyonları bulmak için pratik olmayan büyük bir nüfusun taranması gerektiğini gösterir, ancak yüksek mutajen konsantrasyonu nüfusun yüksek mortaliteye yol açmasına karşın, yetersiz bir mutajize edilen bireylerin sayısı. Etkili bir nüfus geliştirildikten sonra, ilgi bir geni içinde mutasyonları algılamak için birden fazla yol vardır ve platform seçimi, kaynakların deneysel ölçekte ve kullanılabilirliği üzerine bağlıdır. Cel-1 tahlil ve mutant tanımlama için agaroz jel tabanlı yaklaşım, uygun, reproducible ve daha az kaynak yoğun bir platformdur. Bu basit, hiçbir Hesaplamalı bilgi gerektiren, ve özellikle temel Laboratuar donanımları ile genlerin az sayıda doğrulama için uygundur avantajlıdır. Bu yazıda, açıklanan iyi bir Tilling nüfusun geliştirilmesi için yöntemler, doz eğrisi hazırlanması dahil, mutagenez ve mutant nüfusun bakımı, ve mutant nüfusun tarama PCR tabanlı cel-1 tahlil kullanarak .
Introduction
Genomlarda nokta mutasyonları araştırmacılar için birçok yararlı amaca hizmet edebilir. Kendi doğası ve konuma bağlı olarak, Bu mutasyonlar genler ve hatta ilgi proteinlerinin farklı etki alanları için işlevler atamak için kullanılabilir. Öte yandan, yeni genetik varyasyonun kaynağı olarak, fenotipleme ekranları kullanılarak istenilen özellikler için yararlı mutasyonlar seçilebilir ve daha fazla ürün iyileştirmesinde kullanılır. Tilling, kimyasal mutagenez ve hedef geni sıralı varyasyon tespiti içeren güçlü bir ters genetik araçtır. İlk Arabidopsis1 ve drosophilia melanogaster2‘ de geliştirilen, eğme nüfusu geliştirilen ve Hexaploid ekmek buğday (Triticum aestivum) gibi birçok küçük tahıl bitkileri kullanılan3, arpa (Hordeum vulgare)4, tetraploidlerin durum buğday (t. Triticumdicoccoides durum)5, diploid buğday (t. bağlantılar)6 ve buğday aegilops tauschii7 “D” genom progenitör . Bu kaynaklar Abiotik ve biyotik stres toleransı8düzenleyen genlerin rollerini doğrulamak için kullanılan, çiçekli zaman düzenleyen9, ve beslenme üstün ürün çeşitleri geliştirmek5.
Eğriltme, etil methanesulfonate (EMS), sodyum azid, n-metil-n-nitrosourea (MNU) ve metil methanesulfonate (MMS) gibi alkilleyici mutajenik ajanlar kullanımı ile birlikte, çeşitli nedenlerle diğer ters genetik araçlar üzerinde avantajları vardır. İlk olarak, mutagenez neredeyse herhangi bir tür veya tesis10 çeşitli yapılabilir ve dönüşüm darboğazından bağımsızdır, özellikle küçük tahıllar durumunda zorlu11. İkincisi, diğer gen doğrulama yaklaşımlar tarafından elde edilebilir nakavt mutasyonlar üreten ek olarak, yanlış ve yapıştırma mutasyonlar bir dizi indüklenen olabilir, hangi faiz proteinlerinin bireysel etki fonksiyonları ayırt edebilir12. Ayrıca, TILLING genom boyunca mutasyonlar ölümsüz bir koleksiyon üretir; Böylece, tek bir nüfus birden fazla genlerin işlevsel doğrulama için kullanılabilir. Buna karşılık, diğer ters genetik Araçları çalışma13altında sadece geni spesifik kaynaklar üretir. TILLING ile tanımlanan yararlı mutasyonlar üreme amaçları için dağıtılabilir ve transjenik olmayan sınıflandırma birçok ülkede hala belirsiz olan gen düzenlemesinin aksine yönetmeliğe tabi değildir. Bu, özellikle uluslararası işlem gören küçük taneler ile ilgilidir14.
TILLING basit ve verimli bir gen doğrulama stratejisidir ve ilgi genlerini araştırmak için mutagenized nüfusun geliştirilmesini gerektirir. Etkili bir mutajize nüfus geliştirmek, bir TILLING bazlı gen doğrulama çalışmasının verimliliğini belirlemenin anahtarıdır. Düşük genel mutasyon frekansına sahip bir eğme nüfusu, istenilen mutasyonlar için pratik olmayan büyük bir nüfusun gösterildiğini gösterir, ancak yüksek mutajen konsantrasyonu nüfusun yüksek mortaliteye yol açan ve yetersiz sayıda mutajize bireyler. İyi bir nüfus geliştirdikten sonra, ilgi genlerinde mutasyonları algılamak için birden fazla yol vardır ve platform seçimi, kaynakların deneysel ölçekte ve kullanılabilirliği üzerine bağlıdır. Tüm genom sıralamaları ve ekzom sıralaması, küçük genomlar15,16ile bitkilerin içinde yer alan tüm mutasyonları karakterize etmek için kullanılmıştır. Ekmek ve durum buğday ve arzu mutasyonlar tanımlamak ve ilgi mutant hatları sipariş için kamu için kullanılabilir iki TILLING nüfus exome sıralamaları yapılmıştır17. Bu arzu mutasyonların kullanılabilirliği açısından büyük bir kamu kaynağıdır; Ancak, gen doğrulama çalışmalarında, vahşi tip hattı faiz aday geni sahip olmalıdır. Ne yazık ki, hala maliyet-başka bir arka planda birkaç aday genlerin ters genetik tabanlı doğrulama için tüm Tilling nüfusun ekzom dizisi için yasak. Amplicon sıralaması ve cel-1 tabanlı bilgiler, buğday içinde hedeflenen nüfuslarda mutasyonları tespit etmek için kullanılmıştır ve cel-1 uygulamaları basit, hiçbir Hesaplamalı bilgi gerektiren, ve özellikle temel ile genlerin az sayıda doğrulama için uygundur Laboratuar Ekipmanları6,18.
Bu yazıda, açıklanan iyi bir Tilling nüfus gelişimi için yöntemler, doz eğrisi hazırlanması dahil, mutagenez ve mutant nüfusun bakımı, ve mutant nüfusun tarama PCR tabanlı cel-1 tahlil kullanarak . Bu protokol zaten gelişen ve Triticum aestivum, Triticum monoccocum6, arpa, aegilops tauchii7ve çeşitli mutagenized nüfusu kullanan başarıyla uygulandı Diğer. Dahil bu yöntemlerin açık detayları ile birlikte araştırmacılar, seçim herhangi bir küçük tahıl bitkisinde bir mutajen olarak EMS kullanarak TILLING nüfus geliştirmek yardımcı olacaktır yararlı ipuçları vardır.
Protocol
Representative Results
Discussion
TILLING, özellikle dönüşüm tabanlı yaklaşımların ciddi darboğazlara sahip olduğu küçük tahıllar için gen doğrulama için son derece değerli bir tersgenetik araçtır. Yüksek mutasyon frekansı ile mutajize edilmiş bir nüfus geliştirmek fonksiyonel genomik etütler yürütmenin önemli adımlardan biridir. Güçlü bir TILLING nüfus geliştirme en önemli adım EMS optimum konsantrasyon belirlemektir. M1 ‘ de% 40-60% hayatta kalma oranı, buğday ve arpa<sup class=…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma USDA Ulusal Gıda ve Tarım Enstitüsü, Hatch proje 1016879 ve Maryland tarım deney Istasyonu tarafından MAES Grant No 2956952 tarafından desteklenmektedir.
Materials
| 96 well 1.1 ml microtubes in microracks | National Scientific | TN0946-08R | For collecting leaf tissues |
| Agarose I biotechnology grade | VWR | 0710-500G | |
| Biosprint 96 DNA Plant Kit | Qiagen | 941558 | Kit for DNA extraction |
| Cel-1 endonuclease | Extracted as described by Till et al 2006 | Single strand specific endonuclease | |
| Centrifuge 5430 R | Eppendorf | ||
| Ethyl methanesulfonate | Sigma Aldrich | M-0880-25G | EMS, Chemical mutagen |
| Freeze Dry/Shell freeze system | Labconco | For lyophilization of leaf tissue | |
| Kingfisher Flex purification system | Thermo fisher scientific | 5400610 | High throughput DNA extraction robot |
| My Taq DNA Polymerase | Bioline | BIO-21107 | |
| Nuclease free water | Sigma aldrich | W4502-1L | |
| NuGenius gel imaging system | Syngene | ||
| Orbit Environ-shaker | Lab-line | ||
| SPECTROstar Nano | BMG LABTECH | Nano drop for DNA quantification | |
| T100 Thermal cycler | BIO-RAD | 1861096 |
References
- McCallum, C. M., Comai, L., Greene, E. A., Henikoff, S. Targeted screening for induced mutations. Nature Biotechnology. 18 (4), 455-457 (2000).
- Bentley, A., MacLennan, B., Calvo, J., Dearolf, C. R. Targeted Recovery of Mutations in Drosophila. Genetics. 156 (3), 1169-1173 (2000).
- Tsai, H., et al. Discovery of Rare Mutations in Populations: TILLING by Sequencing. Plant Physiology. 156 (3), 1257-1268 (2011).
- Caldwell, D. G., et al. A structured mutant population for forward and reverse genetics in Barley (Hordeum vulgare L.). The Plant Journal. 40 (1), 143-150 (2004).
- Hazard, B., et al. Induced Mutations in the Starch Branching Enzyme II ( SBEII ) Genes Increase Amylose and Resistant Starch Content in Durum Wheat. Crop Science. 52 (4), 1754-1766 (2012).
- Rawat, N., et al. A diploid wheat TILLING resource for wheat functional genomics. BMC Plant Biology. 12, 205 (2012).
- Rawat, N., et al. TILL-D: An Aegilops tauschii TILLING Resource for Wheat Improvement. Frontiers in Plant Science. 9, (2018).
- Rawat, N., et al. Wheat Fhb1 encodes a chimeric lectin with agglutinin domains and a pore-forming toxin-like domain conferring resistance to Fusarium head blight. Nature Genetics. 48 (12), 1576-1580 (2016).
- Kippes, N., Chen, A., Zhang, X., Lukaszewski, A. J., Dubcovsky, J. Development and characterization of a spring hexaploid wheat line with no functional VRN2 genes. Theoretical and Applied Genetics. 129 (7), 1417-1428 (2016).
- Greene, E. A., et al. Spectrum of Chemically Induced Mutations From a Large-Scale Reverse-Genetic Screen in Arabidopsis. Genetics. 164 (2), 731-740 (2003).
- Harwood, W. A. Advances and remaining challenges in the transformation of barley and wheat. Journal of Experimental Botany. 63 (5), 1791-1798 (2012).
- Henikoff, S., Comai, L. Single-Nucleotide Mutations for Plant Functional Genomics. Annual Review of Plant Biology. 54 (1), 375-401 (2003).
- Uauy, C., et al. A modified TILLING approach to detect induced mutations in tetraploid and hexaploid wheat. BMC Plant Biology. 9 (1), 115 (2009).
- Uauy, C., Wulff, B. B. H., Dubcovsky, J. Combining Traditional Mutagenesis with New High-Throughput Sequencing and Genome Editing to Reveal Hidden Variation in Polyploid Wheat. Annual Review of Genetics. 51 (1), 435-454 (2017).
- Li, G., et al. The Sequences of 1504 Mutants in the Model Rice Variety Kitaake Facilitate Rapid Functional Genomic Studies. The Plant Cell. 29 (6), 1218-1231 (2017).
- Jiao, Y., et al. A Sorghum Mutant Resource as an Efficient Platform for Gene Discovery in Grasses. The Plant Cell. 28 (7), 1551-1562 (2016).
- Krasileva, K. V., et al. Uncovering hidden variation in polyploid wheat. Proceedings of the National Academy of Sciences. , 201619268 (2017).
- Dong, C., Dalton-Morgan, J., Vincent, K., Sharp, P. A Modified TILLING Method for Wheat Breeding. The Plant Genome. 2 (1), 39-47 (2009).
- Till, B. J., Zerr, T., Comai, L., Henikoff, S. A protocol for TILLING and Ecotilling in plants and animals. Nature Protocols. 1 (5), 2465-2477 (2006).
- Wu, J. -. L., et al. Chemical- and Irradiation-induced Mutants of Indica Rice IR64 for Forward and Reverse Genetics. Plant Molecular Biology. 59 (1), 85-97 (2005).
- Feldman, M., Levy, A. A. Genome Evolution Due to Allopolyploidization in Wheat. Genetics. 192 (3), 763-774 (2012).
- Comai, L. The advantages and disadvantages of being polyploid. Nature Reviews Genetics. 6 (11), 836-846 (2005).
- Guo, H., et al. Development of a High-Efficient Mutation Resource with Phenotypic Variation in Hexaploid Winter Wheat and Identification of Novel Alleles in the TaAGP.L-B1 Gene. Frontiers in Plant Science. 8, (2017).
- Rakszegi, M., et al. Diversity of agronomic and morphological traits in a mutant population of bread wheat studied in the Healthgrain program. Euphytica. 174 (3), 409-421 (2010).
- Tsai, H., Ngo, K., Lieberman, M., Missirian, V., Comai, L. Tilling by Sequencing. Plant Functional Genomics: Methods and Protocols. , 359-380 (2015).
