Desenvolvimento do direcionamento de lesões locais induzidas em populações de genomas (lavoura) em pequenas culturas de grãos por metilo Methanesulfonate mutagenesis

As mutações pontuais nos genomas podem servir a muitos propósitos úteis para os pesquisadores. Dependendo de sua natureza e localização, essas mutações podem ser usadas para atribuir funções a genes ou até mesmo domínios distintos de proteínas de interesse. Por outro lado, como fonte de nova variação genética, mutações úteis podem ser selecionadas para as características desejadas usando telas de fenotipagem e mais utilizadas na melhora da cultura. O TILLING é uma poderosa ferramenta de genética reversa que inclui mutagenese química e detecção de variação de seqüência no gene alvo. Desenvolvido pela primeira vez em Arabidopsis¹ e Drosophilia melanogaster², as populações de lavoura foram desenvolvidas e utilizadas em muitas culturas de grãos pequenos, como o trigo de pão hexapóide (Triticum aestivum)³, cevada (Hordeum vulgare)⁴, trigo duro tetrapóide (t. usambarense duro)⁵, trigo diploide (t. monococcum)⁶ e o progenitor do genoma “D” do trigo Aegilops tauschii⁷ . Esses recursos têm sido utilizados para validar os papéis dos genes na regulação da tolerância ao estresse abiótico e biótico⁸, regulando o tempo de floração⁹e desenvolvendo variedades de culturas nutricionalmente superiores⁵.

O cultivo, juntamente com o uso de agentes mutagênicos alquilantes, como o metilo metanesulfonato (EMS), azida sódica, N-metil-N-nitrosourea (MNU) e metanesulfonato de metilo (MMS), tem vantagens sobre outras ferramentas de genética reversa por várias razões. Em primeiro lugar, a mutagenese pode ser conduzida em praticamente qualquer espécie ou variedade de plantas¹⁰ e é independente do gargalo de transformação, o que é particularmente desafiador no caso de pequenos grãos¹¹. Em segundo lugar, além de gerar mutações Knockout que podem ser obtidas por outras abordagens de validação genética, uma gama de mutações missense e splicing pode ser induzida, o que pode discernir funções de domínios individuais das proteínas de interesse¹². Além disso, o TILLING gera uma coleção imortal de mutações em todo o genoma; assim, uma única população pode ser usada para a validação funcional de genes múltiplos. Em contrapartida, outras ferramentas de genética reversa geram recursos específicos apenas para o gene em estudo¹³. Mutações úteis identificadas através do TILLING podem ser implantadas para fins de reprodução e não estão sujeitas à regulação, diferentemente da edição gênica, cuja classificação não transgênica ainda é incerta em muitos países. Isso se torna especialmente relevante para pequenos grãos que são negociados internacionalmente¹⁴.

O TILLING é uma estratégia de validação genética simples e eficiente e requer que populações mutagenizadas sejam desenvolvidas para investigar genes de interesse. O desenvolvimento de uma população mutagenizada efetiva é fundamental para determinar a eficiência de um estudo de validação de genes baseado em TILLING. Uma população de tilling com uma baixa freqüência total da mutação indica que uma população impraticamente grande deve ser selecionada para mutações desejadas, visto que uma concentração alta do mutagênico conduz à mortalidade elevada na população e a um número insuficiente de indivíduos mutagenizados. Uma vez que uma boa população é desenvolvida, existem várias maneiras de detectar mutações nos genes de interesse, e a escolha da plataforma depende da escala experimental e da disponibilidade de recursos. O sequenciamento do genoma completo e o sequenciamento do exoma têm sido utilizados para caracterizar todas as mutações em populações de lavantes em plantas com pequenos genomas^15,16. O sequenciamento de exome de duas populações de TILLING tem sido realizado em pão e trigo duro e está disponível ao público para identificar mutações desejáveis e ordenar linhas mutantes de interesse¹⁷. É um grande recurso público em termos de disponibilidade de mutações desejáveis; Entretanto, em estudos da validação do gene, a linha do selvagem-tipo deve possuir o gene do candidato do interesse. Infelizmente, ainda é custo-proibitivo para sequenciar o exoma de toda a população de TILLING para validação reversa baseada em genética de alguns genes candidatos em outro fundo. O sequenciamento de amplicon e os ensaios baseados em cel-1 têm sido usados na detecção de mutações em populações direcionadas em trigo, e os ensaios cel-1 são mais simples, não exigindo nenhum conhecimento computacional e são especialmente adequados para a validação de um pequeno número de genes com equipamento de laboratório^6,18.

No presente artigo, descrevem-se métodos para o desenvolvimento de uma boa população de TILLING, incluindo a preparação da curva de dosagem, mutagenese e manutenção da população mutante, e triagem da população mutante usando o ensaio cel-1 baseado em PCR . Este protocolo já foi implementado com sucesso no desenvolvimento e utilização de populações mutagenizadas de Triticum aestivum, Triticum monoccocum⁶, cevada, Aegilops tauchii⁷e várias Outros. Incluídos são detalhes explícitos destes métodos, juntamente com dicas úteis que ajudarão os pesquisadores a desenvolver populações de TILLING, usando EMS como um mutagênico em qualquer planta de grãos de pequeno porte de escolha.