Développement de lésions locales induites par le ciblage dans les génomes (TILLING) Populations dans les cultures de petits grains par l'éthylique Methanesulfonate Mutagenesis

Les mutations ponctuelles dans les génomes peuvent servir à de nombreux fins utiles pour les chercheurs. Selon leur nature et leur emplacement, ces mutations peuvent être utilisées pour attribuer des fonctions à des gènes ou même des domaines distincts de protéines d’intérêt. D’autre part, comme source de nouvelles variations génétiques, des mutations utiles peuvent être sélectionnées pour les caractères souhaités à l’aide d’écrans de phénotypage et davantage utilisées dans l’amélioration des cultures. TILLING est un puissant outil de génétique inverse qui comprend la mutagénèse chimique et la détection de la variation de séquence dans le gène cible. D’abord développé dans Arabidopsis¹ et Drosophilia melanogaster², les populations DE TILLING ont été développées et utilisées dans de nombreuses cultures de petits grains telles que le blé à pain hexaploïde (Triticum aestivum)³, orge (Hordeum vulgare)⁴, blé dur tétraploïde (T. dicoccoides durum)⁵, blé diploïde (T. monococcum)⁶ et l’ancêtre du génome “D” du blé Aegilops tauschii⁷ . Ces ressources ont été utilisées pour valider les rôles des gènes dans la régulation de la tolérance au stress abiotique et biotique⁸, la régulation du temps de floraison⁹, et le développement de variétés de cultures nutritionnellement supérieure⁵.

TILLING, avec l’utilisation d’agents mutagènes alkylants tels que le méthane sulfonate d’éthyle (EMS), l’azide de sodium, N-méthyl-N-nitrosourea (MNU), et le méthanesulfonate de méthyle (MMS), a des avantages sur d’autres outils de génétique inverse pour plusieurs raisons. Tout d’abord, la mutagénèse peut être menée sur pratiquement n’importe quelle espèce ou variété de plante¹⁰ et est indépendante du goulot d’étranglement de transformation, qui est particulièrement difficile dans le cas des petits grains¹¹. Deuxièmement, en plus de générer des mutations knock-out qui peuvent être obtenues par d’autres approches de validation des gènes, une gamme de mutations de mauvais sens et d’épissage peut être induite, ce qui peut discerner les fonctions des domaines individuels des protéines d’intérêt¹². En outre, TILLING génère une collection immortelle de mutations dans tout le génome; ainsi, une seule population peut être utilisée pour la validation fonctionnelle de plusieurs gènes. En revanche, d’autres outils de génétique inversée génèrent des ressources spécifiques uniquement au gène à l’étude¹³. Les mutations utiles identifiées par TILLING peuvent être déployées à des fins de reproduction et ne sont pas soumises à la réglementation, contrairement à l’édition génétique, dont la classification non transgénique est encore incertaine dans de nombreux pays. Cela devient particulièrement pertinent pour les petits grains qui sont négociés à l’échelle internationale¹⁴.

TILLING est une stratégie de validation génétique simple et efficace qui nécessite le développement de populations mutagénaires pour étudier les gènes d’intérêt. Le développement d’une population mutagénaire efficace est essentiel pour déterminer l’efficacité d’une étude de validation génétique basée sur TILLING. Une population de TILLING avec une faible fréquence globale de mutation indique qu’une population peu large doit être examinée pour les mutations désirées, tandis qu’une concentration de mutagène élevée conduit à une mortalité élevée dans la population et un nombre insuffisant de mutagénaires. Une fois qu’une bonne population est développée, il existe de multiples façons de détecter les mutations dans les gènes d’intérêt, et le choix de la plate-forme dépend de l’échelle expérimentale et la disponibilité des ressources. Le séquençage du génome entier et le séquençage de l’exome ont été utilisés pour caractériser toutes les mutations dans les populations de TILLING chez les plantes ayant de petits génomes^15,16. Le séquençage de l’exome de deux populations de TILLING a été effectué dans le pain et le blé dur et est disponible au public pour identifier les mutations souhaitables et commander des lignes mutantes d’intérêt¹⁷. Il s’agit d’une grande ressource publique en termes de disponibilité de mutations souhaitables; cependant, dans les études de validation de gène, la ligne sauvage-type devrait posséder le gène d’intérêt de candidat. Malheureusement, il est encore prohibitif de séquencer l’exome de toute la population de TILLING pour la validation inversée basée sur la génétique de quelques gènes candidats dans un autre contexte. Le séquençage d’amplicon et les essais à base de Cel-1 ont été utilisés pour détecter les mutations dans les populations ciblées dans le blé, et les essais cel-1 sont plus simples, ne nécessitant aucune connaissance computationnelle, et sont particulièrement appropriés pour la validation d’un petit nombre de gènes avec des matériel de laboratoire^6,18.

Dans le présent article, décrits sont des méthodes pour le développement d’une bonne population DE TILLING, y compris la préparation de la courbe de dosage, la mutagénèse et le maintien de la population mutante, et le dépistage de la population mutante en utilisant le PCR-basé Cel-1 test . Ce protocole a déjà été mis en œuvre avec succès dans le développement et l’utilisation des populations mutagénaires de Triticum aestivum, Triticum monoccocum⁶, orge, Aegilops tauchii⁷, et plusieurs autres. On y trouve des détails explicites de ces méthodes ainsi que des conseils utiles qui aideront les chercheurs à développer des populations de TILLING, en utilisant le SME comme mutagène dans n’importe quelle petite usine céréalière de choix.