Ontwikkeling van gerichte lokale laesies bij Genomes (TILLING) populaties in kleine graangewassen door mutageen

Puntmutaties in genomen kunnen vele nuttige doeleinden voor onderzoekers dienen. Afhankelijk van hun aard en locatie kunnen deze mutaties worden gebruikt om functies toe te wijzen aan genen of zelfs afzonderlijke domeinen van eiwitten die van belang zijn. Aan de andere kant kunnen, als bron van nieuwe genetische variatie, nuttige mutaties worden geselecteerd voor gewenste eigenschappen met behulp van fenotypscreens en verder gebruikt bij gewas verbetering. TILLING is een krachtige reverse genetics tool die chemische mutagenese en detectie van sequentie variatie in het doel gen omvat. Voor het eerst ontwikkeld in Arabidopsis¹ en drosophilia melanogaster², zijn Tilling populaties ontwikkeld en gebruikt in veel kleine graangewassen zoals Braam brood tarwe (Triticum aestivum)³, gerst (Hordeum vulgare)⁴, tetraploïde durumtarwe(t. dicoccoides durum)⁵, diploïde tarwe (t. monococcum)⁶ en de “D” genoom voorlopercellen van tarwe aegilops tauschii⁷ . Deze middelen zijn gebruikt om de rollen van genen te valideren bij het reguleren van abiotische en biotische stress tolerantie⁸, het reguleren van bloeitijd⁹, en het ontwikkelen van nutritioneel superieure gewas rassen⁵.

Tilling, samen met het gebruik van alkylerende mutagene agentia zoals ethyl methanesulfonaat (EMS), natrium azide, n-methyl-N-nitrosourea (mnu), en methyl methanesulfonaat (MMS), heeft voordelen ten opzichte van andere reverse genetics tools om verschillende redenen. Ten eerste kan mutagenese worden uitgevoerd op nagenoeg elke soort of variëteit van plant¹⁰ en is deze onafhankelijk van het knelpunt bij de transformatie, wat in het geval van kleine korrels¹¹bijzonder uitdagend is. Ten tweede kan naast het genereren van Knockout-mutaties die kunnen worden verkregen door andere genvalidatiebenaderingen, een reeks missense en splicing-mutaties worden geïnduceerd, die functies van afzonderlijke domeinen van de eiwitten van belang kunnen onderscheiden¹². Bovendien genereert TILLING een onsterfelijke verzameling van mutaties in het genoom; Zo kan een enkele populatie worden gebruikt voor functionele validatie van meerdere genen. Andere tools voor reverse genetica genereren daarentegen alleen middelen die specifiek zijn voor het gen in studie¹³. Nuttige mutaties geïdentificeerd door middel van BETEGELING kunnen worden ingezet voor fokdoeleinden en zijn niet onderworpen aan regulering, in tegenstelling tot het bewerken van genen, waarvan de niet-transgene classificatie in veel landen nog onzeker is. Dit wordt vooral relevant voor kleine granen die internationaal worden verhandeld¹⁴.

TILLING is een eenvoudige en efficiënte genvaliderings strategie en vereist dat mutagenized populaties worden ontwikkeld voor het onderzoeken van genen van belang. Het ontwikkelen van een effectieve gemutageniseerde populatie is de sleutel tot het bepalen van de efficiëntie van een op TILLING gebaseerd gen-valideringsonderzoek. Een TILLING populatie met een lage totale mutatiefrequentie geeft aan dat een onpraktisch grote populatie moet worden gescreend op gewenste mutaties, terwijl een hoge mutagene concentratie leidt tot een hoge sterfte in de populatie en een ontoereikend aantal mutagenized personen. Zodra een goede populatie is ontwikkeld, zijn er meerdere manieren om mutaties in de genen van belang te detecteren, en de keuze van het platform is afhankelijk van de experimentele schaal en beschikbaarheid van middelen. Hele genoom sequentiëren en exoomsequencing sequencing zijn gebruikt om alle mutaties in Tilling populaties in planten met kleine genomen^15,16te karakteriseren. Exome sequencing van twee TILLING populaties is uitgevoerd in brood en durumtarwe en is beschikbaar voor het publiek voor het identificeren van gewenste mutaties en het bestellen van mutant lijnen van belang¹⁷. Het is een grote openbare bron in termen van beschikbaarheid van wenselijk mutaties; in genvaliderings studies moet de wild-type lijn echter het kandidaatgen bezitten dat van belang is. Helaas is het nog steeds kosten-prohibitief om de exoomsequencing van de hele TILLING populatie te sequenties voor reverse-genetica gebaseerde validering van enkele kandidaatgenen op een andere achtergrond. Amplicon-sequencing en cel-1-gebaseerde assays zijn gebruikt bij het opsporen van mutaties in gerichte populaties in tarwe, en cel-1-assays zijn eenvoudiger, vereisen geen computationele kennis en zijn vooral geschikt voor validatie van een klein aantal genen met basis labomateriaal^6,18.

In dit artikel worden beschreven methoden voor de ontwikkeling van een goede TILLING populatie, met inbegrip van de bereiding van de doserings curve, mutagenese en onderhoud van de Mutante populatie, en screening van de Mutante populatie met behulp van de PCR-gebaseerde cel-1 test . Dit protocol is al met succes geïmplementeerd in de ontwikkeling en het gebruik van mutageen populaties van Triticum aestivum, Triticum monoccocum⁶, gerst, aegilops tauchii⁷, en verschillende Anderen. Inbegrepen zijn expliciete details van deze methoden, samen met nuttige tips die onderzoekers helpen bij het ontwikkelen van TILLING-populaties, het gebruik van EMS als een mutagene stof in een kleine graan plant naar keuze.