פיתוח מיקוד המושרה נגעים מקומיים בשנת Genomes (לעיבוד קרקע) אוכלוסיות בגידולים גרעינים קטנים על ידי אתיל מתיונין מוטאנזיס
Summary
המתואר הוא פרוטוקול לפיתוח נגעים מקומיים המושרה הנגרמת בידי האוכלוסייה Genomes (לעיבוד קרקע) בגידולי תבואה קטנים עם שימוש אתיל מתיונין (EMS) כמו מוטגן. כמו כן, מסופק הוא פרוטוקול לגילוי מוטציה באמצעות שיטת Cel-1.
Abstract
פילוח המושרה נגעים מקומיים Genomes (לעיבוד קרקע) הוא כלי הגנטיקה הפוכה רבת עוצמה הכוללת מוטזיס כימי וגילוי של וריאציה רצף בגנים היעד. לעיבוד קרקע הוא כלי גנומיקה פונקציונלי רב ערך עבור אימות גנים, במיוחד בגרגרים קטנים בהם גישות מבוססות שינוי להחזיק מגבלות חמורות. פיתוח אוכלוסיית מוטייציה חזקה הוא המפתח לקביעת היעילות של מחקר ואימות גנים מבוססי לעיבוד קרקע. אוכלוסיית לעיבוד קרקע עם תדר נמוך של מוטציה כוללת מצביעה על כך שאוכלוסיה גדולה מאוד צריכה להיות מוקרן כדי למצוא מוטציות רצויות, בעוד שריכוז מוטפן גבוה מוביל לתמותה גבוהה באוכלוסייה, המובילה ל ספר אנשים מוטניים. לאחר שפותחה אוכלוסייה יעילה, קיימות מספר דרכים לזיהוי מוטציות בגנים של עניין, והבחירה בפלטפורמה תלויה בקנה המידה הניסיוני ובזמינות המשאבים. שיטת Cel-1 וגישה מבוססת ג’ל לזיהוי מוטציה היא נוחה, מנויית ופלטפורמה פחות אינטנסיבית למשאבים. זה יתרון בכך שהוא פשוט, שאינו דורש ידע מעמיק, והוא מתאים במיוחד לאימות של מספר קטן של גנים עם ציוד מעבדה בסיסי. במאמר הנוכחי, מתוארים השיטות לפיתוח של אוכלוסיית לעיבוד טוב, כולל הכנת עקומת המינון, מוטגנזה ותחזוקה של אוכלוסיית המוטציות, והקרנת אוכלוסיית המוטציות באמצעות הטיפול המבוסס על ה-PCR-1 .
Introduction
מוטציות נקודה גנום יכול לשרת מטרות שימושיות רבות עבור חוקרים. בהתאם הטבע והמיקום שלהם, מוטציות אלה ניתן להשתמש כדי להקצות פונקציות לגנים או תחומים שונים של חלבונים של הריבית. מצד שני, כמקור של וריאציה גנטית הרומן, מוטציות שימושיות ניתן לבחור תכונות הרצוי באמצעות מסכי פנוטיפים ובשימוש נוסף שיפור ביבול. לעיבוד קרקע הוא כלי הגנטיקה הפוכה רבת עוצמה הכוללת מוטזיס כימי ואיתור וריאציה של רצף בגן היעד. פותח לראשונה ב arabidopsis1 ו droסופיזם מלאנוסטר2, אוכלוסיות לעיבוד לקרקע פותחו ומנוצל בגידולי תבואה קטנים רבים כגון חיטה של לחם הקסאפואיד (triticum חיטת)3, שעורה ( הורדאוםוולגאר)4, מחיטה הטטרדואיד (t. חיטת דורום)5, חיטה דידואיד (t. monococcum)6 ו-“D” הגנום מחולל חיטה של אייליאופ . משאבים אלה שימשו כדי לאמת את התפקידים של גנים בוויסות העמידות הביוטית וביוטיים ללחץ8, ויסות הפריחה זמן9, ופיתוח זנים היבול מעולה מבחינה תזונתית5.
לעיבוד קרקע, יחד עם השימוש בסוכני מוטאריים אלקיגונים כגון אתיל מתיונין (EMS), נתרן azide, N-מתיל-N-ניטרוסוראה (MNU), ו מתיל מתיונין (MMS), יש יתרונות על פני כלים אחרים גנטיקה הפוכה מכמה סיבות. ראשית, ניתן לנהל מוטגנזה על כל מין או מגוון של צמחים10 והוא בלתי תלוי בצוואר המרה, שהוא מאתגר במיוחד במקרה של גרגרים קטנים11. שנית, בנוסף ליצירת מוטציות הסתרה שניתן להשיג על ידי גישות אחרות אימות גנים, מגוון של מוטציות מוטעית ושחבור יכול להיגרם, אשר יכול להבחין פונקציות של תחומים בודדים של חלבונים של ריבית12. יתר על כן, לעיבוד קרקע מייצרת אוסף בן אלמוות של מוטציות ברחבי הגנום; לפיכך, ניתן להשתמש באוכלוסיה בודדת לאימות פונקציונלי של גנים מרובים. לעומת זאת, כלים אחרים גנטיקה הפוכה ליצור משאבים ספציפיים רק הגן תחת לימוד13. מוטציות שימושיות שזוהו באמצעות לעיבוד קרקע ניתן לפרוס למטרות רבייה אינם כפופים רגולציה, בניגוד לעריכת גנים, שסיווג לא הטרנסגניים עדיין לא בטוח במדינות רבות. הדבר הופך להיות רלוונטי במיוחד לגרגרים קטנים הנסחרים ברחבי העולם14.
לעיבוד קרקע היא אסטרטגיה פשוטה ויעילה לאימות גנים ודורשת אוכלוסיות מוטשות להתפתח לחקירת גנים מעניינים. פיתוח אוכלוסיה מוטבית יעילה היא המפתח לקביעת היעילות של מחקר ואימות גנים מבוססי לעיבוד קרקע. אוכלוסיית לעיבוד קרקע עם תדר נמוך של מוטציה כוללת מצביעה על כך שאוכלוסיה גדולה מאוד צריכה להיות מוקרן למוטציות הרצויות, בעוד שריכוז מוטאני גבוה מוביל לתמותה גבוהה באוכלוסיה ולמספר לא מספיק של אנשים מוטניים. לאחר התפתחות האוכלוסייה הטובה, קיימות מספר דרכים לזיהוי מוטציות בגנים המעניינים, ובחירת הפלטפורמה תלויה בקנה המידה הניסיוני ובזמינות המשאבים. רצף הגנום כולו רצף exome שימשו כדי לאפיין את כל מוטציות באוכלוסיות לעיבוד הצמחים עם קטן גנום15,16. רצף exome של שתי אוכלוסיות לעיבוד קרקע בוצעה בלחם וחיטה דורום זמין לציבור לזיהוי מוטציות רצויות והזמנת קווי מוטציה של עניין17. זהו משאב ציבורי גדול במונחים של זמינות של מוטציות רצויות; עם זאת, בלימודי האימות הגנטי, קו הטיפוס הפראי צריך להחזיק את גן המועמדים המעניין. למרבה הצער, זה עדיין עלות-אוסרני לרצף את האוכלוסייה של כל אוכלוסיית לעיבוד האוכלוסין כולו עבור הפוך גנטיקה מבוססי אימות של כמה גנים מועמד ברקע אחר. Amplicon רצף ו-Cel-1 מבוססי בחני שימשו בזיהוי מוטציות באוכלוסיות ממוקדות חיטה, ו Cel-1 בחני הם פשוט, לא דורש ידע מחשבתי, והם מתאימים במיוחד לאימות של מספר קטן של גנים עם בסיסי ציוד מעבדה6,18.
במאמר הנוכחי, מתוארים שיטות להתפתחות של אוכלוסיית לעיבוד טוב, כולל הכנת עקומת המינון, מוטגנזה ותחזוקה של אוכלוסיית המוטציות, והקרנת אוכלוסיית המוטציות באמצעות השיטה המבוססת על ה-PCR-1 . פרוטוקול זה כבר יושם בהצלחה בפיתוח וניצול אוכלוסיות מוטשות של triticum חיטת, triticum מונובהצטיינות6, שעורה, אגינה tauchii7, ומספר אחרים. כלולים פרטים מפורשת של שיטות אלה יחד עם טיפים שימושיים שיסייעו לחוקרים לפתח אוכלוסיות לעיבוד קרקע, באמצעות EMS כמוטגן בכל צמח דגן קטן של בחירה.
Protocol
Representative Results
Discussion
לעיבוד קרקע הוא כלי גנטיקה הפוכה בעל ערך רב עבור אימות גנים, במיוחד עבור דגנים קטנים שבהם גישות מבוססות שינוי יש צווארי בקבוק רציני11. פיתוח אוכלוסיה מוטדית עם תדר מוטציה גבוהה הוא אחד השלבים הקריטיים בניהול לימודי גנומיקה תפקודית. הצעד החשוב ביותר בפיתוח אוכלוסיית לעיבוד קרק…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על ידי המכון הלאומי של משרד החקלאות של מזון וחקלאות, הצוהר פרויקט 1016879 ו מרילנד תחנת הניסוי החקלאי דרך MAES גרנט מס ‘ 2956952.
Materials
| 96 well 1.1 ml microtubes in microracks | National Scientific | TN0946-08R | For collecting leaf tissues |
| Agarose I biotechnology grade | VWR | 0710-500G | |
| Biosprint 96 DNA Plant Kit | Qiagen | 941558 | Kit for DNA extraction |
| Cel-1 endonuclease | Extracted as described by Till et al 2006 | Single strand specific endonuclease | |
| Centrifuge 5430 R | Eppendorf | ||
| Ethyl methanesulfonate | Sigma Aldrich | M-0880-25G | EMS, Chemical mutagen |
| Freeze Dry/Shell freeze system | Labconco | For lyophilization of leaf tissue | |
| Kingfisher Flex purification system | Thermo fisher scientific | 5400610 | High throughput DNA extraction robot |
| My Taq DNA Polymerase | Bioline | BIO-21107 | |
| Nuclease free water | Sigma aldrich | W4502-1L | |
| NuGenius gel imaging system | Syngene | ||
| Orbit Environ-shaker | Lab-line | ||
| SPECTROstar Nano | BMG LABTECH | Nano drop for DNA quantification | |
| T100 Thermal cycler | BIO-RAD | 1861096 |
References
- McCallum, C. M., Comai, L., Greene, E. A., Henikoff, S. Targeted screening for induced mutations. Nature Biotechnology. 18 (4), 455-457 (2000).
- Bentley, A., MacLennan, B., Calvo, J., Dearolf, C. R. Targeted Recovery of Mutations in Drosophila. Genetics. 156 (3), 1169-1173 (2000).
- Tsai, H., et al. Discovery of Rare Mutations in Populations: TILLING by Sequencing. Plant Physiology. 156 (3), 1257-1268 (2011).
- Caldwell, D. G., et al. A structured mutant population for forward and reverse genetics in Barley (Hordeum vulgare L.). The Plant Journal. 40 (1), 143-150 (2004).
- Hazard, B., et al. Induced Mutations in the Starch Branching Enzyme II ( SBEII ) Genes Increase Amylose and Resistant Starch Content in Durum Wheat. Crop Science. 52 (4), 1754-1766 (2012).
- Rawat, N., et al. A diploid wheat TILLING resource for wheat functional genomics. BMC Plant Biology. 12, 205 (2012).
- Rawat, N., et al. TILL-D: An Aegilops tauschii TILLING Resource for Wheat Improvement. Frontiers in Plant Science. 9, (2018).
- Rawat, N., et al. Wheat Fhb1 encodes a chimeric lectin with agglutinin domains and a pore-forming toxin-like domain conferring resistance to Fusarium head blight. Nature Genetics. 48 (12), 1576-1580 (2016).
- Kippes, N., Chen, A., Zhang, X., Lukaszewski, A. J., Dubcovsky, J. Development and characterization of a spring hexaploid wheat line with no functional VRN2 genes. Theoretical and Applied Genetics. 129 (7), 1417-1428 (2016).
- Greene, E. A., et al. Spectrum of Chemically Induced Mutations From a Large-Scale Reverse-Genetic Screen in Arabidopsis. Genetics. 164 (2), 731-740 (2003).
- Harwood, W. A. Advances and remaining challenges in the transformation of barley and wheat. Journal of Experimental Botany. 63 (5), 1791-1798 (2012).
- Henikoff, S., Comai, L. Single-Nucleotide Mutations for Plant Functional Genomics. Annual Review of Plant Biology. 54 (1), 375-401 (2003).
- Uauy, C., et al. A modified TILLING approach to detect induced mutations in tetraploid and hexaploid wheat. BMC Plant Biology. 9 (1), 115 (2009).
- Uauy, C., Wulff, B. B. H., Dubcovsky, J. Combining Traditional Mutagenesis with New High-Throughput Sequencing and Genome Editing to Reveal Hidden Variation in Polyploid Wheat. Annual Review of Genetics. 51 (1), 435-454 (2017).
- Li, G., et al. The Sequences of 1504 Mutants in the Model Rice Variety Kitaake Facilitate Rapid Functional Genomic Studies. The Plant Cell. 29 (6), 1218-1231 (2017).
- Jiao, Y., et al. A Sorghum Mutant Resource as an Efficient Platform for Gene Discovery in Grasses. The Plant Cell. 28 (7), 1551-1562 (2016).
- Krasileva, K. V., et al. Uncovering hidden variation in polyploid wheat. Proceedings of the National Academy of Sciences. , 201619268 (2017).
- Dong, C., Dalton-Morgan, J., Vincent, K., Sharp, P. A Modified TILLING Method for Wheat Breeding. The Plant Genome. 2 (1), 39-47 (2009).
- Till, B. J., Zerr, T., Comai, L., Henikoff, S. A protocol for TILLING and Ecotilling in plants and animals. Nature Protocols. 1 (5), 2465-2477 (2006).
- Wu, J. -. L., et al. Chemical- and Irradiation-induced Mutants of Indica Rice IR64 for Forward and Reverse Genetics. Plant Molecular Biology. 59 (1), 85-97 (2005).
- Feldman, M., Levy, A. A. Genome Evolution Due to Allopolyploidization in Wheat. Genetics. 192 (3), 763-774 (2012).
- Comai, L. The advantages and disadvantages of being polyploid. Nature Reviews Genetics. 6 (11), 836-846 (2005).
- Guo, H., et al. Development of a High-Efficient Mutation Resource with Phenotypic Variation in Hexaploid Winter Wheat and Identification of Novel Alleles in the TaAGP.L-B1 Gene. Frontiers in Plant Science. 8, (2017).
- Rakszegi, M., et al. Diversity of agronomic and morphological traits in a mutant population of bread wheat studied in the Healthgrain program. Euphytica. 174 (3), 409-421 (2010).
- Tsai, H., Ngo, K., Lieberman, M., Missirian, V., Comai, L. Tilling by Sequencing. Plant Functional Genomics: Methods and Protocols. , 359-380 (2015).
