تطوير استهداف الآفات المحلية المستحثة في الجينوم (TILLING) السكان في محاصيل الحبوب الصغيرة من قبل الطفرات ميثانسولفونات إيثيل
Summary
وصف هو بروتوكول لتطوير الآفات المحلية المستحثة المستهدفة في الجينوم (TILLING) السكان في محاصيل الحبوب الصغيرة مع استخدام ميثانسولفونات إيثيل (EMS) كمغير. كما يتم توفير بروتوكول للكشف عن الطفرات باستخدام SCel-1.
Abstract
استهداف الآفات المحلية المستحثة في الجينوم (TILLING) هو أداة قوية للجينات العكسية التي تشمل الطفرات الكيميائية والكشف عن اختلاف التسلسل في الجينات المستهدفة. TILLING هو أداة علم الجينوم وظيفية قيمة للغاية للتحقق من الجينات، وخاصة في الحبوب الصغيرة التي تتبع النهج القائمة على التحول قيود خطيرة. إن تطوير مجموعة سكانية قوية من المتحولين أمر أساسي لتحديد كفاءة دراسة التحقق من صحة الجينات المستندة إلى TILLING. ويشير عدد السكان الذين يعانون من انخفاض معدل الطفرة الإجمالية إلى أنه يجب فحص عدد كبير من السكان بشكل غير عملي للعثور على الطفرات المطلوبة، في حين أن ارتفاع تركيز الطفرات يؤدي إلى ارتفاع معدل الوفيات بين السكان، مما يؤدي إلى عدم كفاية عدد الأفراد المتحولين. وبمجرد تطوير مجموعة سكانية فعالة، هناك طرق متعددة للكشف عن الطفرات في جين ذي أهمية، ويعتمد اختيار المنصة على النطاق التجريبي وتوافر الموارد. إن منهج Cel-1 القائم على الجل والجيل من الأغاروز لتحديد المتحولين مناسب، ويمكن استنساخه، ومنصة أقل كثافة في استخدام الموارد. ومن المفيد من حيث أنها بسيطة، لا تتطلب أي معرفة حسابية، وأنها مناسبة بشكل خاص للتحقق من صحة عدد صغير من الجينات مع معدات المختبر الأساسية. في هذه المقالة، هي طرق لتطوير السكان TILLING جيدة، بما في ذلك إعداد منحنى الجرعة، والمتحولين والحفاظ على السكان متحولة، وفحص السكان المتحولين باستخدام اختبار Cel-1 المستندة إلى PCR .
Introduction
يمكن أن تخدم الطفرات نقطة في الجينوم العديد من الأغراض المفيدة للباحثين. اعتمادا على طبيعتها وموقعها، يمكن استخدام هذه الطفرات لتعيين وظائف للجينات أو حتى مجالات متميزة من البروتينات ذات الأهمية. ومن ناحية أخرى، يمكن اختيار الطفرات المفيدة، كمصدر للتباين الجيني الجديد، للصفات المرغوبة باستخدام شاشات النماذج الظاهرية وزيادة استخدامها في تحسين المحاصيل. TILLING هو أداة قوية عكس علم الوراثة التي تشمل الطفرات الكيميائية والكشف عن اختلاف التسلسل في الجين المستهدف. وضعت لأول مرة في أرابيدوبسي1 ودروسوفيليا melanogaster2، وقد تم تطوير السكان TILLING واستخدامها في العديد من محاصيل الحبوب الصغيرة مثل القمح الخبز سداسية(Triticum aestivum)3، الشعير(Hordeum vulgare)4، القمح القاسي رباعي الأرجل (T.dicoccoides durum)5، القمح ثنائي الديلويد (T.monococcum)6 و “D” جينوم السلف من القمح Aegilops tauschii7 . وقد استخدمت هذه الموارد للتحقق من أدوار الجينات في تنظيماللاأحيائي والحيوي تحمل الإجهاد 8، وتنظيم وقت المزهرة9،وتطوير أصناف المحاصيل متفوقة من الناحية التغذوية5.
الحرث، جنبا إلى جنب مع استخدام العوامل المطفرة الألكيلات مثل ميثانسولفونات الإيثيل (EMS)، أزيد الصوديوم، N-ميثيل-N-nitrosourea (MNU)، وميثانسولفونات الميثيل (MMS)، له مزايا على غيرها من أدوات علم الوراثة العكسيلعدة أسباب. أولا، يمكن إجراء الطفرات على أي نوع تقريبا أو مجموعة متنوعة من النبات10 ومستقلة عن عنق الزجاجة التحول، وهو أمر صعب بشكل خاص في حالة الحبوب الصغيرة11. ثانيا، بالإضافة إلى توليد الطفرات بالضربة القاضية التي يمكن الحصول عليها من خلال نهج التحقق من صحة الجينات الأخرى، يمكن أن يسبب مجموعة من الطفرات الخاطئة والربط، والتي يمكن تمييز وظائف المجالات الفردية للبروتينات ذات الأهمية12. وعلاوة على ذلك، تولد TILLING مجموعة خالدة من الطفرات في جميع أنحاء الجينوم. وبالتالي، يمكن استخدام مجموعة واحدة للتحقق الوظيفي من الجينات المتعددة. وعلى النقيض من ذلك، فإن أدوات وراثية عكسية أخرى تولد موارد خاصة بالجين فقط تحت الدراسة13. ويمكن نشر الطفرات المفيدة التي يتم تحديدها من خلال TILLING لأغراض التكاثر ولا تخضع للتنظيم، على عكس تحرير الجينات، التي لا يزال تصنيفها غير المعدل وراثيا غير مؤكد في العديد من البلدان. هذا يصبح [توين تو] بشكل خاصّ إلى حبات صغيرة أنّ يكون دوليّا يتاجر14.
الحرث هو استراتيجية بسيطة وفعالة للتحقق من الجينات ويتطلب السكان المتحولين لتطوير هافة الجينات ذات الأهمية. إن تطوير مجموعة سكانية فعالة من المتحولين أمر أساسي لتحديد كفاءة دراسة التحقق من صحة الجينات المستندة إلى TILLING. ويشير عدد السكان الذين يعانون من انخفاض معدل الطفرة الإجمالية إلى أنه يجب فحص عدد كبير من السكان بشكل غير عملي بحثاً عن الطفرات المطلوبة، في حين أن ارتفاع تركيز الطفرات يؤدي إلى ارتفاع معدل الوفيات بين السكان وعدم كفاية عدد السكان. الأفراد المتحولين. وبمجرد تطوير مجموعة جيدة من السكان، هناك طرق متعددة للكشف عن الطفرات في الجينات ذات الأهمية، ويعتمد اختيار المنصة على النطاق التجريبي وتوافر الموارد. وقد استخدم تسلسل الجينوم كله وتسلسل exome لتوصيف جميع الطفرات في مجموعات TILLING في النباتات مع الجينوم الصغيرة15،16. وقد تم تنفيذ تسلسل Exome من اثنين من السكان TILLING في الخبز والقمح القاسي ومتاح للجمهور لتحديد الطفرات المرغوب فيها وترتيب خطوط متحولة من الفائدة17. وهو مورد عام كبير من حيث توافر الطفرات المستصوبة؛ ومع ذلك، في دراسات التحقق من صحة الجينات، يجب أن يمتلك خط من النوع البري الجين المرشح للاهتمام. ولسوء الحظ، لا يزال من الباهظ التكلفة تسلسل الإكسوتومي من جميع سكان TILLING للتحقق من صحة الجينات العكسية القائمة على علم الوراثة لعدد قليل من الجينات المرشحة في خلفية أخرى. وقد استخدمت تسلسل Amplicon والاختبارات المستندة إلى Cel-1 في الكشف عن الطفرات في السكان المستهدفين في القمح، وCel-1 الاختبارات هي أبسط، لا تتطلب أي معرفة حسابية، ومناسبة بشكل خاص للتحقق من صحة عدد صغير من الجينات مع الأساسية معداتالمختبر 6،18.
في هذه المقالة، وصفت هي أساليب لتطوير السكان TILLING جيدة، بما في ذلك إعداد منحنى الجرعة، والمتحولين والحفاظ على السكان متحولة، وفحص السكان المتحولين باستخدام اختبار Cel-1 المستندة إلى PCR . وقد تم بالفعل تنفيذ هذا البروتوكول بنجاح في تطوير واستخدام السكان المتحولين من Triticum aestivum، Triticum monoccocum6، الشعير ، Aegilops tauchii7، والعديد من الاخرين. وشملت تفاصيل صريحة من هذه الأساليب جنبا إلى جنب مع نصائح مفيدة من شأنها أن تساعد الباحثين على تطوير السكان TILLING، وذلك باستخدام EMS كمغيرة في أي مصنع الحبوب الصغيرة من الاختيار.
Protocol
Representative Results
Discussion
TILLING هو أداة وراثية عكسية قيمة للغاية للتحقق من الجينات، وخاصة بالنسبة للحبوب الصغيرة حيث النهج القائمة على التحول لديها اختناقات خطيرة11. تطوير السكان المتحولين مع تردد طفرة عالية هي واحدة من الخطوات الحاسمة في إجراء دراسات الجينوم الوظيفية. الخطوة الأكثر أهمية في تطوير الس?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم هذا العمل المعهد الوطني للأغذية والزراعة التابع لوزارة الزراعة الأمريكية، ومشروع هاتش 1016879، ومحطة ماريلاند للتجارب الزراعية عن طريق منحة MAES رقم 2956952.
Materials
| 96 well 1.1 ml microtubes in microracks | National Scientific | TN0946-08R | For collecting leaf tissues |
| Agarose I biotechnology grade | VWR | 0710-500G | |
| Biosprint 96 DNA Plant Kit | Qiagen | 941558 | Kit for DNA extraction |
| Cel-1 endonuclease | Extracted as described by Till et al 2006 | Single strand specific endonuclease | |
| Centrifuge 5430 R | Eppendorf | ||
| Ethyl methanesulfonate | Sigma Aldrich | M-0880-25G | EMS, Chemical mutagen |
| Freeze Dry/Shell freeze system | Labconco | For lyophilization of leaf tissue | |
| Kingfisher Flex purification system | Thermo fisher scientific | 5400610 | High throughput DNA extraction robot |
| My Taq DNA Polymerase | Bioline | BIO-21107 | |
| Nuclease free water | Sigma aldrich | W4502-1L | |
| NuGenius gel imaging system | Syngene | ||
| Orbit Environ-shaker | Lab-line | ||
| SPECTROstar Nano | BMG LABTECH | Nano drop for DNA quantification | |
| T100 Thermal cycler | BIO-RAD | 1861096 |
References
- McCallum, C. M., Comai, L., Greene, E. A., Henikoff, S. Targeted screening for induced mutations. Nature Biotechnology. 18 (4), 455-457 (2000).
- Bentley, A., MacLennan, B., Calvo, J., Dearolf, C. R. Targeted Recovery of Mutations in Drosophila. Genetics. 156 (3), 1169-1173 (2000).
- Tsai, H., et al. Discovery of Rare Mutations in Populations: TILLING by Sequencing. Plant Physiology. 156 (3), 1257-1268 (2011).
- Caldwell, D. G., et al. A structured mutant population for forward and reverse genetics in Barley (Hordeum vulgare L.). The Plant Journal. 40 (1), 143-150 (2004).
- Hazard, B., et al. Induced Mutations in the Starch Branching Enzyme II ( SBEII ) Genes Increase Amylose and Resistant Starch Content in Durum Wheat. Crop Science. 52 (4), 1754-1766 (2012).
- Rawat, N., et al. A diploid wheat TILLING resource for wheat functional genomics. BMC Plant Biology. 12, 205 (2012).
- Rawat, N., et al. TILL-D: An Aegilops tauschii TILLING Resource for Wheat Improvement. Frontiers in Plant Science. 9, (2018).
- Rawat, N., et al. Wheat Fhb1 encodes a chimeric lectin with agglutinin domains and a pore-forming toxin-like domain conferring resistance to Fusarium head blight. Nature Genetics. 48 (12), 1576-1580 (2016).
- Kippes, N., Chen, A., Zhang, X., Lukaszewski, A. J., Dubcovsky, J. Development and characterization of a spring hexaploid wheat line with no functional VRN2 genes. Theoretical and Applied Genetics. 129 (7), 1417-1428 (2016).
- Greene, E. A., et al. Spectrum of Chemically Induced Mutations From a Large-Scale Reverse-Genetic Screen in Arabidopsis. Genetics. 164 (2), 731-740 (2003).
- Harwood, W. A. Advances and remaining challenges in the transformation of barley and wheat. Journal of Experimental Botany. 63 (5), 1791-1798 (2012).
- Henikoff, S., Comai, L. Single-Nucleotide Mutations for Plant Functional Genomics. Annual Review of Plant Biology. 54 (1), 375-401 (2003).
- Uauy, C., et al. A modified TILLING approach to detect induced mutations in tetraploid and hexaploid wheat. BMC Plant Biology. 9 (1), 115 (2009).
- Uauy, C., Wulff, B. B. H., Dubcovsky, J. Combining Traditional Mutagenesis with New High-Throughput Sequencing and Genome Editing to Reveal Hidden Variation in Polyploid Wheat. Annual Review of Genetics. 51 (1), 435-454 (2017).
- Li, G., et al. The Sequences of 1504 Mutants in the Model Rice Variety Kitaake Facilitate Rapid Functional Genomic Studies. The Plant Cell. 29 (6), 1218-1231 (2017).
- Jiao, Y., et al. A Sorghum Mutant Resource as an Efficient Platform for Gene Discovery in Grasses. The Plant Cell. 28 (7), 1551-1562 (2016).
- Krasileva, K. V., et al. Uncovering hidden variation in polyploid wheat. Proceedings of the National Academy of Sciences. , 201619268 (2017).
- Dong, C., Dalton-Morgan, J., Vincent, K., Sharp, P. A Modified TILLING Method for Wheat Breeding. The Plant Genome. 2 (1), 39-47 (2009).
- Till, B. J., Zerr, T., Comai, L., Henikoff, S. A protocol for TILLING and Ecotilling in plants and animals. Nature Protocols. 1 (5), 2465-2477 (2006).
- Wu, J. -. L., et al. Chemical- and Irradiation-induced Mutants of Indica Rice IR64 for Forward and Reverse Genetics. Plant Molecular Biology. 59 (1), 85-97 (2005).
- Feldman, M., Levy, A. A. Genome Evolution Due to Allopolyploidization in Wheat. Genetics. 192 (3), 763-774 (2012).
- Comai, L. The advantages and disadvantages of being polyploid. Nature Reviews Genetics. 6 (11), 836-846 (2005).
- Guo, H., et al. Development of a High-Efficient Mutation Resource with Phenotypic Variation in Hexaploid Winter Wheat and Identification of Novel Alleles in the TaAGP.L-B1 Gene. Frontiers in Plant Science. 8, (2017).
- Rakszegi, M., et al. Diversity of agronomic and morphological traits in a mutant population of bread wheat studied in the Healthgrain program. Euphytica. 174 (3), 409-421 (2010).
- Tsai, H., Ngo, K., Lieberman, M., Missirian, V., Comai, L. Tilling by Sequencing. Plant Functional Genomics: Methods and Protocols. , 359-380 (2015).
