Sviluppo di popolazioni indotte di lesioni locali indotte dal targeting NEI genomi (TILLING) in colture di grano piccolo mediante mutagenesi metannata etilareale
Summary
Descritto è un protocollo per lo sviluppo di una popolazione di lesioni locali indotte di targeting IN genomi (TILLING) in piccole colture di grano con l’uso di metanosofato etilico (EMS) come mutageno. È inoltre previsto un protocollo per il rilevamento delle mutazioni utilizzando il saggio Cel-1.
Abstract
Targeting Induced Local Lesions IN Genomes (TILLING) è un potente strumento di genetica inversa che include la mutagenesi chimica e il rilevamento della variazione della sequenza nei geni bersaglio. TILLING è uno strumento di genomica funzionale di grande valore per la convalida genica, specialmente in piccoli grani in cui gli approcci basati sulla trasformazione hanno gravi limitazioni. Lo sviluppo di una solida popolazione mutagenizzata è fondamentale per determinare l’efficienza di uno studio sulla convalida genica basata su TILLING. Una popolazione TILLING con una bassa frequenza di mutazione complessiva indica che una popolazione impraticabile di grandi dimensioni deve essere sottoposta a screening per trovare le mutazioni desiderate, mentre un’elevata concentrazione di mutageni porta ad un’elevata mortalità nella popolazione, che porta a un’insufficiente numero di individui mutagenizzati. Una volta sviluppata una popolazione efficace, ci sono diversi modi per rilevare le mutazioni in un gene di interesse, e la scelta della piattaforma dipende dalla scala sperimentale e dalla disponibilità delle risorse. L’approccio basato sul gel Cel-1 e agarose per l’identificazione dei mutanti è conveniente, riproducibile e una piattaforma meno ad alta intensità di risorse. È vantaggioso in quanto è semplice, non richiede alcuna conoscenza computazionale, ed è particolarmente adatto per la convalida di un piccolo numero di geni con attrezzature di laboratorio di base. Nel presente articolo, descritti sono i metodi per lo sviluppo di una buona popolazione TILLING, compresa la preparazione della curva di dosaggio, la mutagenesi e il mantenimento della popolazione mutante, e lo screening della popolazione mutante utilizzando il saggio Cel-1 basato su PCR .
Introduction
Le mutazioni puntiformi nei genomi possono servire a molti scopi utili per i ricercatori. A seconda della loro natura e della loro posizione, queste mutazioni possono essere utilizzate per assegnare funzioni ai geni o anche a domini distinti di proteine di interesse. D’altra parte, come fonte di una nuova variazione genetica, possono essere selezionate mutazioni utili per i tratti desiderati utilizzando schermi fenotipizzazione e ulteriormente utilizzati nel miglioramento delle colture. TILLING è un potente strumento di genetica inversa che include la mutagenesi chimica e il rilevamento della variazione di sequenza nel gene bersaglio. Sviluppati per la prima volta in Arabidopsis1 e Drosophilia melanogaster2, le popolazioni TILLING sono state sviluppate e utilizzate in molte piccole colture di grano come il grano exaploide (Triticum aestivum)3, orzo (Ordeum vulgare)4, grano tetraploiddur (T. dicoccoides durum)5, grano diploide (T. monococcum)6 e il progenitore del genoma “D” del grano Aegilops tauschii7 . Queste risorse sono state utilizzate per convalidare i ruoli dei geninella regolazione della tolleranza allo stress abiotico e biotico 8, regolando il tempo di fioritura9e sviluppando varietà di colture nutrizionalmente superiori5.
TILLING, insieme all’uso di agenti mutagenici alchilanti come il metaenesonero etilico (EMS), l’azide di sodio, N-metile-N-nitrosourea (MNU) e il metetanonero (MMS) hanno vantaggi rispetto ad altri strumenti di genetica inversa per diversi motivi. In primo luogo, la mutagenesi può essere condotta praticamente su qualsiasi specie o varietà di piante10 ed è indipendente dal collo di bottiglia di trasformazione, che è particolarmente impegnativo nel caso di piccoli grani11. In secondo luogo, oltre a generare mutazioni da knockout che possono essere ottenute con altri approcci di convalida genica, si può indotta una serie di mutazioni errate e splicing, che possono discernere le funzioni dei singoli domini delle proteine di interesse12. Inoltre, TILLING genera una raccolta immortale di mutazioni in tutto il genoma; pertanto, una singola popolazione può essere utilizzata per la convalida funzionale di più geni. Al contrario, altri strumenti di genetica inversa generano risorse specifiche solo per il gene oggetto dello studio13. Le mutazioni utili identificate tramite TILLING possono essere impiegate per scopi riproduttivi e non sono soggette a regolazione, a differenza dell’editing genetico, la cui classificazione non transgenica è ancora incerta in molti paesi. Questo diventa particolarmente rilevante per i piccoli grani che sono scambiati a livello internazionale14.
TILLING è una strategia di convalida genica semplice ed efficiente e richiede lo sviluppo di popolazioni mutagenizzate per studiare i geni di interesse. Lo sviluppo di una popolazione mutagenizzata efficace è fondamentale per determinare l’efficienza di uno studio di convalida genica basato su TILLING. Una popolazione TILLING con una bassa frequenza di mutazione complessiva indica che una popolazione impraticabile di grandi dimensioni deve essere sottoposta a screening per le mutazioni desiderate, mentre un’elevata concentrazione di mutageni porta ad un’elevata mortalità nella popolazione e a un numero insufficiente di mutantizzati. Una volta sviluppata una buona popolazione, ci sono diversi modi per rilevare le mutazioni nei geni di interesse, e la scelta della piattaforma dipende dalla scala sperimentale e dalla disponibilità delle risorse. Il sequenziamento dell’intero genoma e il sequenziamento degli esomi sono stati utilizzati per caratterizzare tutte le mutazioni nelle popolazioni di TILLING in piante con piccoli genomi15,16. Il sequenziamento dell’esoma di due popolazioni di TILLING è stato eseguito nel pane e nel grano durum ed è a disposizione del pubblico per identificare mutazioni desiderabili e ordinare linee mutanti di interesse17. È una grande risorsa pubblica in termini di disponibilità di mutazioni desiderabili; tuttavia, negli studi di convalida genica, la linea wild-type dovrebbe possedere il gene candidato di interesse. Sfortunatamente, è ancora proibitivo sequenziare l’esoma dell’intera popolazione TILLING per la convalida inversa basata sulla genetica di alcuni geni candidati in un altro background. Il sequenziamento dell’amplicone e i saggi basati su Cel-1 sono stati utilizzati per rilevare le mutazioni nelle popolazioni mirate nel grano, e i test Cel-1 sono più semplici, non richiedono alcuna conoscenza computazionale e sono particolarmente adatti per la convalida di un piccolo numero di geni con attrezzature di laboratorio6,18.
Nel presente articolo, descritti sono metodi per lo sviluppo di una buona popolazione TILLING, compresa la preparazione della curva di dosaggio, la mutagenesi e il mantenimento della popolazione mutante, e lo screening della popolazione mutante utilizzando il saggio Cel-1 basato su PCR . Questo protocollo è già stato implementato con successo nello sviluppo e nell’utilizzo di popolazioni mutagenizzate di Triticum aestivum, Triticum monoccocum6, orzo, Aegilops tauchii7,e diversi Altri. Sono inclusi dettagli espliciti di questi metodi insieme a suggerimenti utili che aiuteranno i ricercatori a sviluppare popolazioni TILLING, utilizzando EMS come mutageno in qualsiasi piccola pianta di grano di scelta.
Protocol
Representative Results
Discussion
TILLING è uno strumento di genetica inversa molto prezioso per la convalida genica, in particolare per i cereali di piccole dimensioni in cui gli approcci basati sulla trasformazione presentano gravi colli di bottiglia11. Lo sviluppo di una popolazione mutagenizzata con un’alta frequenza di mutazione è uno dei passi critici nello svolgimento di studi genomici funzionali. Il passo più importante nello sviluppo di una popolazione TILLING robusta è quello di determinare la concentrazione ottimale…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dall’USDA National Institute of Food and Agriculture, progetto Hatch 1016879 e Maryland Agricultural Experiment Station tramite MAES Grant N. 2956952.
Materials
| 96 well 1.1 ml microtubes in microracks | National Scientific | TN0946-08R | For collecting leaf tissues |
| Agarose I biotechnology grade | VWR | 0710-500G | |
| Biosprint 96 DNA Plant Kit | Qiagen | 941558 | Kit for DNA extraction |
| Cel-1 endonuclease | Extracted as described by Till et al 2006 | Single strand specific endonuclease | |
| Centrifuge 5430 R | Eppendorf | ||
| Ethyl methanesulfonate | Sigma Aldrich | M-0880-25G | EMS, Chemical mutagen |
| Freeze Dry/Shell freeze system | Labconco | For lyophilization of leaf tissue | |
| Kingfisher Flex purification system | Thermo fisher scientific | 5400610 | High throughput DNA extraction robot |
| My Taq DNA Polymerase | Bioline | BIO-21107 | |
| Nuclease free water | Sigma aldrich | W4502-1L | |
| NuGenius gel imaging system | Syngene | ||
| Orbit Environ-shaker | Lab-line | ||
| SPECTROstar Nano | BMG LABTECH | Nano drop for DNA quantification | |
| T100 Thermal cycler | BIO-RAD | 1861096 |
References
- McCallum, C. M., Comai, L., Greene, E. A., Henikoff, S. Targeted screening for induced mutations. Nature Biotechnology. 18 (4), 455-457 (2000).
- Bentley, A., MacLennan, B., Calvo, J., Dearolf, C. R. Targeted Recovery of Mutations in Drosophila. Genetics. 156 (3), 1169-1173 (2000).
- Tsai, H., et al. Discovery of Rare Mutations in Populations: TILLING by Sequencing. Plant Physiology. 156 (3), 1257-1268 (2011).
- Caldwell, D. G., et al. A structured mutant population for forward and reverse genetics in Barley (Hordeum vulgare L.). The Plant Journal. 40 (1), 143-150 (2004).
- Hazard, B., et al. Induced Mutations in the Starch Branching Enzyme II ( SBEII ) Genes Increase Amylose and Resistant Starch Content in Durum Wheat. Crop Science. 52 (4), 1754-1766 (2012).
- Rawat, N., et al. A diploid wheat TILLING resource for wheat functional genomics. BMC Plant Biology. 12, 205 (2012).
- Rawat, N., et al. TILL-D: An Aegilops tauschii TILLING Resource for Wheat Improvement. Frontiers in Plant Science. 9, (2018).
- Rawat, N., et al. Wheat Fhb1 encodes a chimeric lectin with agglutinin domains and a pore-forming toxin-like domain conferring resistance to Fusarium head blight. Nature Genetics. 48 (12), 1576-1580 (2016).
- Kippes, N., Chen, A., Zhang, X., Lukaszewski, A. J., Dubcovsky, J. Development and characterization of a spring hexaploid wheat line with no functional VRN2 genes. Theoretical and Applied Genetics. 129 (7), 1417-1428 (2016).
- Greene, E. A., et al. Spectrum of Chemically Induced Mutations From a Large-Scale Reverse-Genetic Screen in Arabidopsis. Genetics. 164 (2), 731-740 (2003).
- Harwood, W. A. Advances and remaining challenges in the transformation of barley and wheat. Journal of Experimental Botany. 63 (5), 1791-1798 (2012).
- Henikoff, S., Comai, L. Single-Nucleotide Mutations for Plant Functional Genomics. Annual Review of Plant Biology. 54 (1), 375-401 (2003).
- Uauy, C., et al. A modified TILLING approach to detect induced mutations in tetraploid and hexaploid wheat. BMC Plant Biology. 9 (1), 115 (2009).
- Uauy, C., Wulff, B. B. H., Dubcovsky, J. Combining Traditional Mutagenesis with New High-Throughput Sequencing and Genome Editing to Reveal Hidden Variation in Polyploid Wheat. Annual Review of Genetics. 51 (1), 435-454 (2017).
- Li, G., et al. The Sequences of 1504 Mutants in the Model Rice Variety Kitaake Facilitate Rapid Functional Genomic Studies. The Plant Cell. 29 (6), 1218-1231 (2017).
- Jiao, Y., et al. A Sorghum Mutant Resource as an Efficient Platform for Gene Discovery in Grasses. The Plant Cell. 28 (7), 1551-1562 (2016).
- Krasileva, K. V., et al. Uncovering hidden variation in polyploid wheat. Proceedings of the National Academy of Sciences. , 201619268 (2017).
- Dong, C., Dalton-Morgan, J., Vincent, K., Sharp, P. A Modified TILLING Method for Wheat Breeding. The Plant Genome. 2 (1), 39-47 (2009).
- Till, B. J., Zerr, T., Comai, L., Henikoff, S. A protocol for TILLING and Ecotilling in plants and animals. Nature Protocols. 1 (5), 2465-2477 (2006).
- Wu, J. -. L., et al. Chemical- and Irradiation-induced Mutants of Indica Rice IR64 for Forward and Reverse Genetics. Plant Molecular Biology. 59 (1), 85-97 (2005).
- Feldman, M., Levy, A. A. Genome Evolution Due to Allopolyploidization in Wheat. Genetics. 192 (3), 763-774 (2012).
- Comai, L. The advantages and disadvantages of being polyploid. Nature Reviews Genetics. 6 (11), 836-846 (2005).
- Guo, H., et al. Development of a High-Efficient Mutation Resource with Phenotypic Variation in Hexaploid Winter Wheat and Identification of Novel Alleles in the TaAGP.L-B1 Gene. Frontiers in Plant Science. 8, (2017).
- Rakszegi, M., et al. Diversity of agronomic and morphological traits in a mutant population of bread wheat studied in the Healthgrain program. Euphytica. 174 (3), 409-421 (2010).
- Tsai, H., Ngo, K., Lieberman, M., Missirian, V., Comai, L. Tilling by Sequencing. Plant Functional Genomics: Methods and Protocols. , 359-380 (2015).
