エチルメタンスルホン酸変異体による小粒作物におけるゲノム中の標的誘導局所病変(TILLING)集団の開発
Summary
記載は、エチルメタンスルホネート(EMS)をミュータゲンとして使用する小さな穀物作物における標的誘導局所病変(TILLING)集団を開発するためのプロトコルである。また、Cel-1アッセイを用いて変異検出するためのプロトコルも提供される。
Abstract
標的化された局所病変INゲノム(TILLING)は、化学的変異と標的遺伝子の配列変動の検出を含む強力な逆遺伝学ツールです。TILLINGは、特に変換ベースのアプローチが重大な制限を持つ小さな粒において、遺伝子検証のための非常に貴重な機能ゲノミクスツールです。堅牢な変異型集団を開発することは、TILLINGベースの遺伝子検証研究の効率性を決定する鍵となります。全体的な突然変異頻度が低いTILLING集団は、望ましい変異を見つけるために非現実的に大きな集団をスクリーニングする必要があることを示し、一方、高い変異原濃度は集団の死亡率が高く、不十分につながる変異型個体の数。効果的な集団が開発されると、対象遺伝子の変異を検出する複数の方法があり、プラットフォームの選択は、リソースの実験規模と可用性に依存します。変異体同定のためのCel-1アッセイおよびアガロースゲルベースのアプローチは便利で、再生可能で、資源集約的なプラットホームである。それは簡単で、計算上の知識を必要としないという点で有利であり、基本的な実験室装置を用いて少数の遺伝子の検証のために特に適している。本記事では、投与曲線の調製、変異集団の変異形成および維持、およびPCRベースのCel-1アッセイを用いた変異型集団のスクリーニングを含む、良好なTILLING集団の開発方法を説明する。.
Introduction
ゲノムの点の突然変異は、研究者にとって多くの有用な目的を果たすことができます。その性質と位置に応じて、これらの突然変異は、目的のタンパク質の遺伝子または異なるドメインに機能を割り当てるために使用することができます。一方、新規な遺伝的変異の源として、表現型スクリーンを用いて所望の形質に有用な変異を選択し、さらに作物改善に使用することができる。TILLINGは、化学的変異および標的遺伝子の配列変動の検出を含む強力な逆遺伝学ツールです。アラビドプシス1とショウジョウフィリアメラノガスター2で最初に開発され、TILLING集団は、ヘキサプロイドパン小麦(トリチカム・アエスチバム)3などの多くの小さな穀物作物で開発され、利用されています。大麦(大群)4, テトラプロイドデュラム小麦 (T. ディコカイドデュラム)5, ジプロイド小麦 (T. モノコカム)6と小麦エージロップスタウスキイの“D” ゲノム前駆者 7.これらのリソースは、アバイオティクスおよび生物学的ストレス耐性8を調節し、開花時間9を調節し、栄養的に優れた作物品種5を開発する遺伝子の役割を検証するために使用されてきた。
TILLINGは、エチルメタンスルホン酸エチル、アジドナトリウム、N-メチル-N-ニトロスール(MNU)、メチルメタンスルホネート(MMS)などのアルキル化変異剤剤の使用と共に、いくつかの理由から他の逆遺伝学ツールよりも優れています。第1に、変異は、実質的に任意の種または種々の植物10に対して行うことができ、小粒11の場合には特に困難である形質転換のボトルネックとは無関係である。第二に、他の遺伝子検証アプローチによって得られるノックアウト変異を生成することに加えて、様々な誤解およびスプライシング変異を誘導することができ、これは目的とするタンパク質の個々のドメインの機能を識別することができる12。さらに、TILLINGはゲノム全体に変異の不滅のコレクションを生成します。したがって、単一の集団を複数の遺伝子の機能的検証に使用できます。対照的に、他の逆遺伝学ツールは、研究13下の遺伝子のみに固有のリソースを生成する。TILLINGを通じて同定された有用な突然変異は、繁殖目的で展開することができ、多くの国で非トランスジェニック分類が依然として不確実である遺伝子編集とは異なり、規制の対象とならない。これは、国際的に取引されている小さな穀物に特に関連します14.
TILLINGは、シンプルで効率的な遺伝子検証戦略であり、目的の遺伝子を調るために変異型集団を開発する必要があります。効果的な変異型集団の開発は、TILLINGベースの遺伝子検証研究の効率を決定する鍵となります。全体的な突然変異頻度が低いTILLING集団は、望ましい変異に対して実質的に大きな集団をスクリーニングする必要があることを示し、一方、高い変異原濃度は集団の死亡率が高く、その数が不十分であることを示している。変異型個体。良好な集団が発達すると、対象遺伝子の変異を検出する複数の方法があり、プラットフォームの選択は、リソースの実験規模と可用性に依存します。全ゲノムシーケンシングおよびエキソメシーケンシングは、小さなゲノム15、16を有する植物におけるTILLING集団における全変異を特徴付けるために使用されてきた。2つのTILLING集団のエキソメ配列決定は、パンおよびデュラム小麦で行われており、望ましい変異を同定し、関心のある変異線を注文するために一般に利用可能である17。これは、望ましい突然変異の可用性の面で大きな公共リソースです。しかし、遺伝子検証研究では、野生型の線は目的の候補遺伝子を持つべきである。残念ながら、別の背景にあるいくつかの候補遺伝子の逆遺伝学ベースの検証のために、TILLING集団全体のエキソメを配列することは依然としてコストがかかります。アンプリコンシーケンシングとCel-1ベースのアッセイは、小麦の標的集団における変異の検出に使用されており、Cel-1アッセイはより単純で、計算知識を必要としないため、特に基本的な少数の遺伝子の検証に適しています。ラボ機器6,18.
本記事では、投与曲線の調製、変異集団の変異形成および維持、およびPCRベースのCel-1アッセイを用いた変異型集団のスクリーニングを含む、良好なTILLING集団の開発のための方法を説明する。.このプロトコルは、トリチカム・アエスチダム、トリチカム・モノッコカム6、大麦、エージロップス・タウチイ7、およびいくつかの変異集団の開発と利用において既に成功している。他。これらの方法の明示的な詳細と、研究者が選択した小さな穀物植物の変異原としてEMSを使用して、TILLING集団を開発するのに役立つ有用なヒントが含まれています。
Protocol
Representative Results
Discussion
TILLINGは遺伝子検証のための非常に貴重な逆遺伝学ツールであり、特に変換ベースのアプローチが深刻なボトルネックを持つ小さな穀物に対して11.高い変異頻度で変異化集団を開発することは、機能的ゲノミクス研究を行う上で重要なステップの1つである。堅牢なTILLING集団を開発する上で最も重要なステップは、EMSの最適濃度を決定することです。M1における40%〜60%…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、USDA国立食糧農業研究所、ハッチプロジェクト1016879、およびMAESグラント第2956952号を介してメリーランド農業実験ステーションによって支援されました。
Materials
| 96 well 1.1 ml microtubes in microracks | National Scientific | TN0946-08R | For collecting leaf tissues |
| Agarose I biotechnology grade | VWR | 0710-500G | |
| Biosprint 96 DNA Plant Kit | Qiagen | 941558 | Kit for DNA extraction |
| Cel-1 endonuclease | Extracted as described by Till et al 2006 | Single strand specific endonuclease | |
| Centrifuge 5430 R | Eppendorf | ||
| Ethyl methanesulfonate | Sigma Aldrich | M-0880-25G | EMS, Chemical mutagen |
| Freeze Dry/Shell freeze system | Labconco | For lyophilization of leaf tissue | |
| Kingfisher Flex purification system | Thermo fisher scientific | 5400610 | High throughput DNA extraction robot |
| My Taq DNA Polymerase | Bioline | BIO-21107 | |
| Nuclease free water | Sigma aldrich | W4502-1L | |
| NuGenius gel imaging system | Syngene | ||
| Orbit Environ-shaker | Lab-line | ||
| SPECTROstar Nano | BMG LABTECH | Nano drop for DNA quantification | |
| T100 Thermal cycler | BIO-RAD | 1861096 |
References
- McCallum, C. M., Comai, L., Greene, E. A., Henikoff, S. Targeted screening for induced mutations. Nature Biotechnology. 18 (4), 455-457 (2000).
- Bentley, A., MacLennan, B., Calvo, J., Dearolf, C. R. Targeted Recovery of Mutations in Drosophila. Genetics. 156 (3), 1169-1173 (2000).
- Tsai, H., et al. Discovery of Rare Mutations in Populations: TILLING by Sequencing. Plant Physiology. 156 (3), 1257-1268 (2011).
- Caldwell, D. G., et al. A structured mutant population for forward and reverse genetics in Barley (Hordeum vulgare L.). The Plant Journal. 40 (1), 143-150 (2004).
- Hazard, B., et al. Induced Mutations in the Starch Branching Enzyme II ( SBEII ) Genes Increase Amylose and Resistant Starch Content in Durum Wheat. Crop Science. 52 (4), 1754-1766 (2012).
- Rawat, N., et al. A diploid wheat TILLING resource for wheat functional genomics. BMC Plant Biology. 12, 205 (2012).
- Rawat, N., et al. TILL-D: An Aegilops tauschii TILLING Resource for Wheat Improvement. Frontiers in Plant Science. 9, (2018).
- Rawat, N., et al. Wheat Fhb1 encodes a chimeric lectin with agglutinin domains and a pore-forming toxin-like domain conferring resistance to Fusarium head blight. Nature Genetics. 48 (12), 1576-1580 (2016).
- Kippes, N., Chen, A., Zhang, X., Lukaszewski, A. J., Dubcovsky, J. Development and characterization of a spring hexaploid wheat line with no functional VRN2 genes. Theoretical and Applied Genetics. 129 (7), 1417-1428 (2016).
- Greene, E. A., et al. Spectrum of Chemically Induced Mutations From a Large-Scale Reverse-Genetic Screen in Arabidopsis. Genetics. 164 (2), 731-740 (2003).
- Harwood, W. A. Advances and remaining challenges in the transformation of barley and wheat. Journal of Experimental Botany. 63 (5), 1791-1798 (2012).
- Henikoff, S., Comai, L. Single-Nucleotide Mutations for Plant Functional Genomics. Annual Review of Plant Biology. 54 (1), 375-401 (2003).
- Uauy, C., et al. A modified TILLING approach to detect induced mutations in tetraploid and hexaploid wheat. BMC Plant Biology. 9 (1), 115 (2009).
- Uauy, C., Wulff, B. B. H., Dubcovsky, J. Combining Traditional Mutagenesis with New High-Throughput Sequencing and Genome Editing to Reveal Hidden Variation in Polyploid Wheat. Annual Review of Genetics. 51 (1), 435-454 (2017).
- Li, G., et al. The Sequences of 1504 Mutants in the Model Rice Variety Kitaake Facilitate Rapid Functional Genomic Studies. The Plant Cell. 29 (6), 1218-1231 (2017).
- Jiao, Y., et al. A Sorghum Mutant Resource as an Efficient Platform for Gene Discovery in Grasses. The Plant Cell. 28 (7), 1551-1562 (2016).
- Krasileva, K. V., et al. Uncovering hidden variation in polyploid wheat. Proceedings of the National Academy of Sciences. , 201619268 (2017).
- Dong, C., Dalton-Morgan, J., Vincent, K., Sharp, P. A Modified TILLING Method for Wheat Breeding. The Plant Genome. 2 (1), 39-47 (2009).
- Till, B. J., Zerr, T., Comai, L., Henikoff, S. A protocol for TILLING and Ecotilling in plants and animals. Nature Protocols. 1 (5), 2465-2477 (2006).
- Wu, J. -. L., et al. Chemical- and Irradiation-induced Mutants of Indica Rice IR64 for Forward and Reverse Genetics. Plant Molecular Biology. 59 (1), 85-97 (2005).
- Feldman, M., Levy, A. A. Genome Evolution Due to Allopolyploidization in Wheat. Genetics. 192 (3), 763-774 (2012).
- Comai, L. The advantages and disadvantages of being polyploid. Nature Reviews Genetics. 6 (11), 836-846 (2005).
- Guo, H., et al. Development of a High-Efficient Mutation Resource with Phenotypic Variation in Hexaploid Winter Wheat and Identification of Novel Alleles in the TaAGP.L-B1 Gene. Frontiers in Plant Science. 8, (2017).
- Rakszegi, M., et al. Diversity of agronomic and morphological traits in a mutant population of bread wheat studied in the Healthgrain program. Euphytica. 174 (3), 409-421 (2010).
- Tsai, H., Ngo, K., Lieberman, M., Missirian, V., Comai, L. Tilling by Sequencing. Plant Functional Genomics: Methods and Protocols. , 359-380 (2015).
