Entwicklung von Targeting Induzierte lokale Läsionen IN Genomen (TILLING) Populationen in Kleinkornkulturen durch Ethylmethansulfonat-Mutagenese
Summary
Described ist ein Protokoll zur Entwicklung einer Targeting Induced Local Lesions IN Genomes (TILLING) Population in Kleinkornkulturen mit Verwendung von Ethylmethansulfonat (EMS) als Mutagen. Ebenfalls zur Verfügung gestellt wird ein Protokoll zur Mutationsdetektion mit dem Cel-1-Assay.
Abstract
Targeting Induced Local Lesions IN Genomes (TILLING) ist ein leistungsstarkes Reverse-Genetik-Tool, das chemische Mutagenese und den Nachweis von Sequenzvariationen in Zielgenen umfasst. TILLING ist ein sehr wertvolles funktionelles Genomik-Tool für die Genvalidierung, insbesondere in kleinen Körnern, bei denen transformationsbasierte Ansätze ernsthafte Grenzen haben. Die Entwicklung einer robusten mutagenisierten Population ist der Schlüssel zur Bestimmung der Effizienz einer TILLING-basierten Genvalidierungsstudie. Eine TILLING-Population mit einer niedrigen Gesamtmutationshäufigkeit weist darauf hin, dass eine unpraktisch große Population untersucht werden muss, um gewünschte Mutationen zu finden, während eine hohe Mutagenkonzentration zu einer hohen Sterblichkeit in der Bevölkerung führt, was zu einer unzureichenden Anzahl der mutagenisierten Personen. Sobald eine effektive Population entwickelt ist, gibt es mehrere Möglichkeiten, Mutationen in einem Gen von Interesse zu erkennen, und die Wahl der Plattform hängt von der experimentellen Größe und Verfügbarkeit von Ressourcen ab. Der Cel-1-Assay- und Agarose-Gel-basierte Ansatz zur mutierten Identifizierung ist bequem, reproduzierbar und eine weniger ressourcenintensive Plattform. Es ist insofern von Vorteil, als es einfach ist, ohne Rechenkenntnisse, und es eignet sich besonders für die Validierung einer kleinen Anzahl von Genen mit grundlegenden Laborgeräten. In diesem Artikel werden die Methoden zur Entwicklung einer guten TILLING-Population beschrieben, einschließlich der Vorbereitung der Dosierungskurve, der Mutagenese und der Erhaltung der mutierten Population und des Screenings der mutierten Population mit dem PCR-basierten Cel-1-Assay. .
Introduction
Punktmutationen in Genomen können vielen nützlichen Zwecken für Forscher dienen. Je nach Art und Standort können diese Mutationen verwendet werden, um Genen oder sogar unterschiedlichen Bereichen von Proteinen von Interesse Funktionen zuzuweisen. Andererseits können als Quelle neuartiger genetischer Variationen nützliche Mutationen für gewünschte Merkmale ausgewählt werden, indem Phänotypisierungssiebe verwendet werden, die weiter bei der Verbesserung der Ernte verwendet werden. TILLING ist ein leistungsstarkes Reverse-Genetik-Tool, das chemische Mutagenese und den Nachweis von Sequenzvariationen im Zielgen umfasst. Zuerst entwickelt in Arabidopsis1 und Drosophilia melanogaster2, TILLING Populationen wurden entwickelt und in vielen kleinen Getreidekulturen wie Hexaploid Brot Weizen (Triticum aestivum)3verwendet Gerste (Hordeum vulgare)4, tetraploider Hartweizen (T. dicoccoides durum)5, diploider Weizen (T. monococcum)6 und der “D” Genom Vorläufer von Weizen Aegilops tauschii7 . Diese Ressourcen wurden verwendet, um die Rolle von Genen bei der Regulierung der abiotischen und biotischen Stresstoleranz8zu validieren, die Blütezeit9zu regulieren und ernährungsphysiologisch überlegene Pflanzensorten zu entwickeln5.
TILLING, zusammen mit der Verwendung von alkyliernden mutagenen Erbgutverändern wie Ethylmetschenulfonat (EMS), Natriumazid, N-Methyl-N-Nitrosourea (MNU) und Methylmethansulfonat (MMS), hat aus mehreren Gründen Vorteile gegenüber anderen Reverse-Genetik-Werkzeugen. Erstens kann die Mutagenese an praktisch jeder Art oder Sorte der Pflanze10 durchgeführt werden und ist unabhängig vom Transformationsengpass, der bei Kleinkörnern besonders anspruchsvoll ist11. Zweitens können neben der Erzeugung von Knockout-Mutationen, die durch andere Genvalidierungsansätze erreicht werden können, eine Reihe von Missense- und Spleißmutationen induziert werden, die Funktionen einzelner Domänen der von Interesse interessierten Proteine erkennen können12. Darüber hinaus erzeugt TILLING eine unsterbliche Sammlung von Mutationen im gesamten Genom; So kann eine einzige Population für die funktionelle Validierung mehrerer Gene verwendet werden. Im Gegensatz dazu erzeugen andere Reverse-Genetik-Tools Ressourcen, die nur für das in Studie13unterfessliche Gen spezifisch sind. Nützliche Mutationen, die durch TILLING identifiziert werden, können zu Zuchtzwecken eingesetzt werden und unterliegen nicht der Regulierung, im Gegensatz zur Genbearbeitung, deren nicht-transgene Klassifizierung in vielen Ländern noch unsicher ist. Dies wird besonders relevant für kleine Körner, die international gehandelt werden14.
TILLING ist eine einfache und effiziente Genvalidierungsstrategie und erfordert die Entwicklung von mutagenisierten Populationen zur Untersuchung von Genen von Interesse. Die Entwicklung einer effektiven mutagenisierten Population ist der Schlüssel zur Bestimmung der Effizienz einer TILLING-basierten Genvalidierungsstudie. Eine TILLING-Population mit einer niedrigen Gesamtmutationshäufigkeit weist darauf hin, dass eine unpraktisch große Population auf gewünschte Mutationen untersucht werden muss, während eine hohe Mutagenkonzentration zu einer hohen Sterblichkeit in der Bevölkerung und einer unzureichenden Anzahl von mutagenisierte Individuen. Sobald eine gute Population entwickelt ist, gibt es mehrere Möglichkeiten, Mutationen in den Genen von Interesse zu erkennen, und die Wahl der Plattform hängt von der experimentellen Größe und Verfügbarkeit von Ressourcen ab. Ganze Genomsequenzierung und Exomsequenzierung wurde verwendet, um alle Mutationen in TILLING-Populationen in Pflanzen mit kleinen Genomen15,16zu charakterisieren. Die Exome-Sequenzierung von zwei TILLING-Populationen wurde in Brot und Hartweizen durchgeführt und steht der Öffentlichkeit zur Verfügung, um wünschenswerte Mutationen zu identifizieren und mutierte Interessenslinien zu ordnen17. Es ist eine große öffentliche Ressource in Bezug auf die Verfügbarkeit von wünschenswerten Mutationen; In Genvalidierungsstudien sollte die Wildtyplinie jedoch das Kandidatengen besitzen, das von Interesse ist. Leider ist es immer noch kostenprohibitiv, das Exom der gesamten TILLING-Population für die umgekehrte genetische Validierung einiger Kandidatengene in einem anderen Hintergrund zu sequenzieren. Amplicon-Sequenzierung und Cel-1-basierte Assays wurden verwendet, um Mutationen in zielgerichteten Populationen im Weizen zu erkennen, und Cel-1-Assays sind einfacher, erfordern keine Computerkenntnisse und eignen sich besonders für die Validierung einer kleinen Anzahl von Genen mit Laborausrüstung6,18.
In diesem Artikel werden Methoden zur Entwicklung einer guten TILLING-Population beschrieben, einschließlich der Vorbereitung der Dosierungskurve, der Mutagenese und der Erhaltung der mutierten Population und des Screenings der mutierten Population mit dem PCR-basierten Cel-1-Assay. . Dieses Protokoll wurde bereits erfolgreich bei der Entwicklung und Nutzung von mutagenisierten Populationen von Triticum aestivum, Triticum monoccocum6, Gerste, Aegilops tauchii7und Andere. Enthalten sind explizite Details dieser Methoden zusammen mit nützlichen Tipps, die Forschern helfen, TILLING Populationen zu entwickeln, mit EMS als Mutagen in jeder kleinen Getreidepflanze ihrer Wahl.
Protocol
Representative Results
Discussion
TILLING ist ein sehr wertvolles Reverse-Genetik-Tool für die Genvalidierung, insbesondere für kleine Körner, bei denen transformationsbasierte Ansätze gravierende Engpässe haben11. Die Entwicklung einer mutagenisierten Population mit einer hohen Mutationshäufigkeit ist einer der entscheidenden Schritte bei der Durchführung funktioneller Genomstudien. Der wichtigste Schritt bei der Entwicklung einer robusten TILLING-Population ist die Bestimmung der optimalen Konzentration von EMS. Die Über…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde vom USDA National Institute of Food and Agriculture, Hatch Project 1016879 und Maryland Agricultural Experiment Station via MAES Grant No. 2956952 unterstützt.
Materials
| 96 well 1.1 ml microtubes in microracks | National Scientific | TN0946-08R | For collecting leaf tissues |
| Agarose I biotechnology grade | VWR | 0710-500G | |
| Biosprint 96 DNA Plant Kit | Qiagen | 941558 | Kit for DNA extraction |
| Cel-1 endonuclease | Extracted as described by Till et al 2006 | Single strand specific endonuclease | |
| Centrifuge 5430 R | Eppendorf | ||
| Ethyl methanesulfonate | Sigma Aldrich | M-0880-25G | EMS, Chemical mutagen |
| Freeze Dry/Shell freeze system | Labconco | For lyophilization of leaf tissue | |
| Kingfisher Flex purification system | Thermo fisher scientific | 5400610 | High throughput DNA extraction robot |
| My Taq DNA Polymerase | Bioline | BIO-21107 | |
| Nuclease free water | Sigma aldrich | W4502-1L | |
| NuGenius gel imaging system | Syngene | ||
| Orbit Environ-shaker | Lab-line | ||
| SPECTROstar Nano | BMG LABTECH | Nano drop for DNA quantification | |
| T100 Thermal cycler | BIO-RAD | 1861096 |
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