השתלת כימוגנטית מהונדס בקליפת המוח ושלתי לתוך המוחות המוקדמים של העכבר לנטאל

בעלי חיים נולדו ושוכנו בהתאם לחוק בעלי חיים בבריטניה (הליכים מדעיים) (1986). הערה: עבור הדור של pCAGGs-hM3D (ג ‘ י)-IRES-RFP לבנות, קטע של סאלי-StuI, המכיל את hM3D (הג) רצף, כבר מבודד פלממיד 50463 (Addgene), והוכנס לתוך הביטוי וקטור pCAGGs-RFP (מתנה של F. Guillemot) מתעכל עם קסהוי-אכרוב 1. הכנת העובר העכבר פרוסות קורטיקלית לחטא ציוד מעבדה (למשל, מיקרוסקופים סטריאו) ומשטחים (למשל, ספסלים) עם הממס ניקוי המתאים ו 70% אתנול (אטוח) פתרון במים (H2O). השתמש בכלי הניתוח שהיו באוטוקלשים ולשמור אותם כל הזמן ב 100% אטוה. הכינו 3 20 mL של 4% הטמפ ‘ הנמוכה ביותר בטמפרטורת מאגר של 1 x פוספט (PBS), בצינורות של 50 mL, ושמרו אותם ב-55 ° c. להקריב עכברים בהריון על ידי נקע בצוואר הרחם ב 13.5 או 14.5 ימים של ההיריון (יום מעובי 13.5-E 23.4). עם זוג של מספריים לחיתוך, לפתוח את הבטן של עכברים בהריון, להסיר את קרני הרחם (עם העוברים) ולמקם אותם בתמיסת קרבס קר (שולחן 1), בצלחת פטרי 90 מ”מ. עם זוג של מלקחיים בסדר התלמיד ישר, לפתוח את שקי השפיר, להסיר את העוברים ולהעביר אותם בתמיסת קרבס טרי קר, בצלחת פטרי חדשה 90 מ”מ. לנתח את המוח העובר העכבר (המוח הקדמי, אמצע המוח, החוצה המוח) משאר הגוף העובר. החזקת המוח גזור מן המוח הפגר, להעביר אותם בתמיסת קרבס קר ב-90 מילימטר חדש צלחת פטרי, ולשמור אותם על קרח. עם עט עמיד למים, צייר קו ישר במשטח החיצוני, באמצע החלק התחתון של 6 35 מנות פטרי מילימטר. מקום אחד 4% נמוך-gelling עשר העשרה בשעה 37 ° c עבור 5 דקות. מיד לאחר מכן המסכן 10 mL ב 2 35 מ”מ מנות פטרי ולהטביע את המוח גזור.הערה: את הריח צריך לעמוד כלפי מטה (בתחתית צלחת פטרי). להטביע 3-4 מוחות לכל צלחת פטרי, ליישר אותם בקו ישר שצויר בעבר. השאר מרווח של 3 מילימטר. בין שני מוחות חזור על שלבים 1.8 ו-1.9 עד שכל המוחות המוגזור הוטבעו. מניחים את המוח המוטבע ב -4 ° c, כדי לחזק את הצמח, ולאחר מכן לגלף את שלושת המוחות לבלוק אחד של גודל ואוריינטציה מתאימים.הערה: השאירו כ 3 מ”מ מסביב לקצות דגימות המוח. שינוי הכיוון של המוח, עם הנורות ריח על גבי. הדבק את הבלוק על פני השטח של בסיס מיקרוטום ובאמצעות להב כירורגי לחתוך כל הדרך בתחתית הבלוק, בין שני המוחות, על מנת ליצור 3 בלוקים עצמאיים (כל מיני בלוק המכיל מוח אחד). מקטע את הבלוקים, בתמיסת קרבס קר כקרח, לתוך 250 יקרומטר פרוסות עבות, באמצעות להב רוטט מיקרוטומה. עם מיקרו-מרית שטוח בסופו של דבר לאסוף רק את הפרוסות המכילות את המדיליאלים או caulionic מקואל (MGE או CGE; איור 1) ובנפרד להעביר אותם על ממברנות מסנן (13 יקרומטר קוטר, 8.0 יקרומטר גודל הנקבוביות), צף על מדיום חיוני מינימלי (זיכרון, שולחן 1) ב פוליסטירן מרכז-מנות תרבות עוגב (60 מ”מ x 15 מ”מ). מניחים את הכלים בחממה לתרבות הרקמה של CO2 , ב-37 ° c, במשך 1, והיכונו לאלקטרופורציה המרכזית. 2. אלקטרופורציה חדה במוח לפני תחילת ההליך אלקטרופורציה, להכין 50 mL של 1% העלה ג’ל בצלחת פטרי 100 מ”מ. השאירו את הג ג’ל כדי לגבש בטמפרטורת החדר (RT) במשך כ 30 דקות. הכנת עמודות agarose זעיר (קוטר 1 מ”מ ו 10 מ”מ אורך), מנוקב עם פיפטה זכוכית (225 מ”מ אורך; 2 mL קיבולת) ולהעביר אותם פתרונות קרבס קר הקרח.הערה: הנורה טפטפת גומי מתאים 2 להפיפטות mL מחוברת לפיפטה, ועל ידי לחיצה עליו את העמודה ניתן לשחרר מן הצנרת זכוכית לפתרון Krebs. עם להב כירורגי, גזור גושי agarose קטנים של שני גדלים: אחד קטן שיתאים על פני השטח של האלקטרודה (ראה להלן) ואחד גדול, אשר ישמש כבסיס לביצוע זריקות ה-DNA המוקד לתוך פרוסות המוח. להעביר את אבני agarose בפתרון קרבס קר גם. הכן את הגדרת הזריקות המרכזית ואת האלקטרופורציה החריפה (איור 2).הערה: עבור הזריקות, הציוד הבא נדרש: 1) שדה בהיר לנתיחה סטריאו מיקרוסקופ, 2) מזרק פניאומטי משאבת, 3) מיקרומניפולציה, 4) עמדה מגנטית, ו 5) צלחת פלדה בסיס. עבור electroporation הפרוסה החדה, הציוד הבא נדרש: 1) אחד מרובע פלטינה 10 מ”מ צלחת פטרי אלקטרודה, 2) ריבוע אחד פלטינה 10 מ”מ לכסות אלקטרודה, 3) מיקרומניפולציה, ו 4) אלקטרופורטור. הזרקת דנ א מוקד להכין תערובת DNA של ביטוי וקטורים: pCAGGs-IRES-GFP (שליטה וקטור) + pCAGGs-hM3D (ג ‘ קיו)-IRES-RFP, בריכוז של 1 μg/μL עבור כל וקטור ולהוסיף פתרון ירוק מהיר (מניות 25 מ”ג/mL) ב 1/10 דילול. למלא מיקרופיפטה זכוכית משכה (0.5 מ”מ קוטר פנימי 1 מ”מ קוטר חיצוני) עם 10 μL של תערובת ה-DNA ולהזריק כמויות קטנות (על הטווח 25-50 nL) לתוך האזור שנבחר (MGE/CGE) של הפרוסה (איור 1 ואיור 2). אלקטרופורציה חריפההערה: האלקטרופורציה צריכה להתבצע מיד. לאחר הזרקת הדי. אנ. איי המרכזית מניחים את הבלוק agarose קטן על האלקטרודה צלחת פטרי ולצרף את העמודה agarose לתוך האלקטרודה לכסות ניידים בעזרת מיקרו-מרית הסתיימה שטוח. העבר את הפרוסה עם הממברנה התומכת שלו אל הבלוק של agarose והקצה את האלקטרודה העליונה עם העמודה agarose על גבי האזור שנבחר (MGE/CGE) של הפרוסה.הערה: טעינת המתח של 125 V (שני פולסים של 5 ms כל, מרווח 500 ms) תניב אלקטרופורציה מוצלחת (איור 3). לאחר האלקטרופורציה, מניחים את הפרוסה עם הקרום התומך שלה בתוך המנה ומעבירים את המנה בחממה לתרבות הרקמה של CO2 , ב-37 ° c. לאחר השעה 1, החלף את המדיום הראשי עבור מדיום בסיסי המתאים לתרבויות הנוירואליות הראשיות (תא עצב בינוני בסיסי; שולחן 1) ומודיית את הפרוסות לילה, תמורת כ 18-24 h. 3. הכנת תא-שתלי בדוק את יעילות האלקטרופורציה בכל הפרוסות. בחר רק את הפרוסות שבהן מספר מקובל של תאי פלורסנט נצפה (איור 3).הערה: אלקטרופורה כ-30 פרוסות/לכל ניסוי כדי להשיג את מספר התאים המתאים להשתלת (ראה להלן). לנתח את האזור שנבחר (MGE/CGE) מכל פרוסה וחותכים את הרקמה לתוך חתיכות קטנות בתמיסת קרבס קר בקרח, תחת ניתוח פלורסנט מיקרוסקופ-סטריאו. בינתיים, המקום שפופרת 1.5 mL עם 900 μL תא עצב בסיסי בינוני באמבט מים ב 37 ° c. העבר את חתיכות הרקמה עם P1000 מיקרופיפיאור לצינור 1.5 mL המכיל 500 μL של L15/DNase בינוני מוכן על ידי הוספת 100 μL של 1 מ”ג/mL DNase מלאי ב-d/F12 בינונית לתוך 900 μL של L15 medium. לשטוף את חתיכות הרקמה על ידי הקשה. הוסף 100 μL של DNase (מניות 1 מ”ג/mL ב dמדיום/F12 בינונית) לתוך מדיום בסיסית 900 μL. להיפטר L15/DNase בינונית ולהשעות מחדש את חתיכות הרקמה 200 μL תא עצב בסיסי/DNase בינוני מוכן בשלב 3.5. הגדרת P200 מיקרופיפיפיאור כדי 180 μL ומכנית הנתק את חתיכות הרקמה על ידי ליטוף למעלה ולמטה בעדינות, 20-30 פעמים, עד חלקה ו “קרם” השעיה מתקבל. הוסף 200 μL של תא עצב בסיסי/DNase בינונית (הנפח הכולל הסופי 400 μL) והשעיה מחדש. לקחת 4 μL ליטר של תאים, לדלל כראוי והר על המוגלובין. תחת מיקרוסקופ שדה בהיר, בדוק את יעילות הדיסוציאציה וספור את מספר התאים.הערה: אם הדיסוציאציה היא מוצלחת, בהיר (בחיים) תאים בודדים ולא אגרגטים תאים יהיה נצפתה. תא צנטריפוגה השעיה משלב 3.8, ב 1,000 rpm, ב RT, עבור 5 דקות, ולאחר מכן, להסיר את supernatant מן הצינור ולהוסיף את המדיום L15/DNase המתאים (בדרך כלל 5-7 μL) כך הריכוז הסופי של תאים יהיה 8 x 105-1.2 x 106 תאים/μL.הערה: במהלך ההשעיה, חשוב מאוד להימנע בועות אוויר. מניחים את התא סדרת מחלקים על הקרח ויש להם עוד L15/dnase בינונית עבור זריקות. 4. זריקות תוך-גולגולתי הערה: ההליכים הבאים מתקיימים בחדר הליכים בתוך מתקן בית החיות. מאז התאים ייזריקו ישירות למוח של גורים היילוד מבלי לחשוף את המוח, מצבים אספטי נשמרים על ידי חיטוי מרחב העבודה עם 70% הפתרון אטוח ושימוש במחטים זכוכית אוטוקלבה. הציוד הבא נדרש עבור זריקות תוך גולגולתי: 1) שדה בהיר לנתיחה סטריאו מיקרוסקופ, 2) מיקרו מזרק, ו 3) משטח חימום להתאוששות העכבר. הכינו מחט זכוכית על ידי משיכת מחטים בהתאם להמלצות של היצרן. מחטי זכוכית עם קוטר החיצוני 80 יקרומטר, 40 יקרומטר קוטר פנימי, ו-30 ° משופע משמשות בפרוטוקול זה.הערה: כפי שהוזכר לעיל, יש להשתמש במחטים לפני השימוש. Backfill באופן ידני את המחט עם שמן אדיש ביולוגית באמצעות 30 G, 2 המחט אינטש מזרק. להרכיב ולהכניס את המחט ליחידת מזרק על פי הוראות היצרן. קבע את הגדרות ההזרקה באמצעי האחסון המרבי (69 nL) וקצב איטי יחסי (23 nL/s). רוקן את המחט עד שהבוכנה מורחבת לגמרי. . תמלא את המחט חותכים חתיכה קטנה מקלטת השתלה ומניחים אותו תחת לחיתוך שדה בהיר-מיקרוסקופ סטריאו. עם P10 מיקרופיפטה, להעביר 5 μL מן המדגם (תא aliquot) אל הקלטת, כך ירידה כדורית נוצרת. מניחים את קצה המחט לתוך המדגם וממלאים את המחט (הבוכנה מופרע הזה בו ומציירת את המדגם עם זה).הערה: מאז המדגם צריך להיות צמיגי למדי, למלא את המחט בשלבים קטנים כך את המדגם יהיה שיווי משקל, ובקצב איטי המונע בועות מיצירת. המדגם צריך להיות חלק והומוגנית בתוך המחט. אם המדגם הוא צמיגי מדי ולא ניתן למלא את המחט, להוסיף L15/DNase בינונית כפי שהוא נדרש כדי לקבל את צמיגות הנכון. אף על פי כן, זה ישנה את ריכוז המדגם, ובאופן אידיאלי יש להימנע. הרדים גורים חדשים שנולדו (יום לפני הלידה 0-2 [P0-P2]) על קרח עבור 2-5 דקות.הערה: . תוודא שכלבלב לא זז מניחים את הגור רדימים תחת השדה בהיר לנתיחה סטריאו מיקרוסקופ. לבצע 3-4 זריקות של 69 nL כל אחד בחצי הכדור.הערה: אתרי ההזרקה ממוקמים כ 1 מ”מ לרוחב לקו האמצע, ו בין 1 מ”מ caudal לברגמה ו 1 מ”מ rostral לקו הפנימי. קצה המחט צריך להיות ממוקם בערך 1 מ”מ עמוק משטח pial. לאחר כל הזרקה, המחט נשאר במקום בערך 30 s ונסוג בתקופות. מיד לאחר הזריקות, מניחים את הגור על משטח חימום עם חימום בסביבה הנמוכה ביותר (37 ° c). כאשר הגור מתאושש להעביר אותו לכלוב עם אמו.הערה: לעולם אל תעזוב את האמא. בלי כלבלבים בכלוב ההליך כולו (מהסרת הגור מן החברים האחרים שלו, עד שהוא מוחזר) צריך להימשך פחות מ 10 דקות. 5. clozapine-N-תחמוצת הזריקות הכן את ליגד ligand, CNO פתרון מניות על ידי דילול 1 מ”ג של CNO ב 50 μL של diמתיל סולפוקסיד (DMSO) עד הפתרון הוא שקוף. Top-עד 10 mL עם מלוחים כך הריכוז הסופי של CNO הוא 0.1 mg/mL.הערה: . DMSO רעיל הימנע משימוש בו לריכוז גבוה יותר מ 0.1%. השתמש כפקד פתרון מלוחים המכיל את אותו ריכוז DMSO כמו הפתרון המכיל CNO. מיום הלידה 14 ו 3 ימים באופן מחודש (P14-P16), בכל עכבר לבצע שני הפנימי (כגון) זריקות של CNO (ריכוז CNO: 1 מ”ג/ק”ג) או 0.05% DMSO ב תמיסת מלח, ליום, 12 h בנפרד. ביום האחרון (P17), לבצע הזרקה בודדת ולהקריב עכברים על ידי פריקה צוואר הרחם בתוך חלון זמן של 30 דקות-1 h.