Transplantation de progéniteurs interneuron corticales génétiquement modifiés dans les cerveaux de souris postnatales précoces

Les animaux ont été élevés et logés conformément à la United Kingdom Animals (Scientific Procedures) Act (1986). REMARQUE: Pour la génération de la construction pCAGGs-hM3D(Gq)-IRES-RFP, un fragment de SalI-StuI, contenant la séquence hM3D(Gq), a été isolé du plasmide 50463 (Addgene), et inséré dans l’expression vector eCAGGs-RFP (cadeau de F. Guillemot) XhoI-EcoRV. 1. Préparation des tranches corticales d’embryon de souris Stériliser l’équipement de laboratoire (p. ex. les microscopes stéréo) et les surfaces (p. ex., bancs) avec un solvant détergent approprié et une solution d’éthanol à 70 % (EtOH) dans l’eau (H2O). Utilisez des outils de dissection qui ont été autoclaved et les garder tout le temps dans 100% EtOH. Préparer trois aliquots de 20 ml d’agarose à basse température de 4 % dans une solution tampon de 1 x phosphate (PBS), dans des tubes de 50 ml, et les maintenir à 55 oC. Sacrifier les souris enceintes par luxation cervicale à 13,5 ou 14,5 jours de gestation (jour embryonnaire E13.5-E14.5). Avec une paire de ciseaux de dissection, ouvrez l’abdomen des souris enceintes, retirez les cornes utérines (avec les embryons) et placez-les dans la solution Krebs glacée (tableau1), dans un plat Petri de 90 mm. Avec une paire de forceps fins d’étudiant droit, ouvrez les sacs amniotiques, enlevez les embryons et transférez-les dans la solution Krebs glacée fraîche, dans un nouveau plat Petri de 90 mm. Disséquer le cerveau de l’embryon de souris (avant-cerveau, cerveau du milieu, cerveau postérieur) du reste du corps embryonnaire. Tenir les cerveaux disséqués de l’arrière-cerveau, les transférer dans la solution Krebs glacée dans un nouveau plat Petri de 90 mm, et les garder sur la glace. À l’impétude, tracez une ligne droite à la surface extérieure, au milieu de la partie inférieure de six plats Petri de 35 mm. Placez un agarose/PBS de 4 % à faible gelde 20 mL à 37 oC pendant 5 min. Immédiatement après, pauvre 10 ml dans deux plats Petri de 35 mm et intégrez les cerveaux disséqués.REMARQUE: Les ampoules olfactives doivent faire face vers le bas (en bas du plat Petri). Intégrer 3-4 cerveaux par plat Petri, les aligner dans la ligne droite précédemment dessiné. Laissez de l’espace de 3 à 5 mm entre les deux cerveaux. Répétez les étapes 1.8 et 1.9 jusqu’à ce que tous les cerveaux disséqués aient été incorporés. Placez les cerveaux intégrés à 4 oC, afin que l’agarose se solidifie, et sculptez ensuite les trois cerveaux en un seul bloc de taille et d’orientation appropriées.REMARQUE: Laisser environ 3 mm autour des bords des échantillons de cerveau. Changer l’orientation des cerveaux, avec les ampoules olfactives sur le dessus. Coller le bloc sur la surface d’une base de microtome et à l’aide d’une lame chirurgicale coupé tout le chemin à travers le fond du bloc, entre chacun des deux cerveaux, afin de créer 3 blocs indépendants (chaque mini bloc contenant un cerveau). Sectionnez les blocs, dans la solution Krebs glacée, en tranches de 250 m d’épaisseur, à l’aide d’un microtome de lame vibrante. À l’insu d’une micro-spatule pliée à l’aile plate, ne recueillir que les tranches contenant les éminences ganglioniques médiales ou caudales (MGE ou CGE; Figure 1) et les transférer individuellement sur des membranes filtrantes (13 m de diamètre, 8,0 millions de pore), flottant sur un support essentiel minimal (MEM, tableau 1) dans des plats de culture d’organes en polystyrène (60 mm x 15 mm). Placer les plats dans un incubateur de culture tissulaire CO 2, à 37 oC, pendant 1 h, et préparer l’électroporation focale. 2. Électroporation aigu de tranche de cerveau Avant de commencer la procédure d’électroporation, préparer 50 ml de gel agarose de 1 % dans un plat Petri de 100 mm. Laisser le gel d’agarose se solidifier à température ambiante (RT) pendant environ 30 min. Préparer de minuscules colonnes d’agarose (1 mm de diamètre et 10 mm de longueur), poinçonnées à l’eau-d’œuvre en verre (225 mm de longueur; 2 ml de capacité) et les transférer dans des solutions Krebs glacées.REMARQUE: Une ampoule de goutte-à-goutte en caoutchouc appropriée pour des pipettes de 2 ml est attachée à la pipette, et en la pressant la colonne peut être libérée de la pipette en verre à la solution de Krebs. À l’aide d’une lame chirurgicale, coupez de petits blocs d’agarose de deux tailles : un petit qui s’adaptera à la surface de l’électrode (voir ci-dessous) et un plus grand, qui servira de base pour effectuer les injections d’ADN focal dans les tranches de cerveau. Transférer les blocs d’agarose dans la solution Krebs glacée ainsi. Préparer la mise en place des injections focales et de l’électroporation aigue (figure 2).REMARQUE: Pour les injections, l’équipement suivant est nécessaire : 1) un stéréomicroscope de dissection de champ lumineux, 2) un injecteur pneumatique de pico-pompe, 3) un micromanipulateur, 4) un support magnétique, et 5) une plaque de base en acier. Pour l’électroporation de tranche aigue, l’équipement suivant est nécessaire : 1) un platine carré 10 mm électrode de boîte Petri, 2) un platine carré 10 mm électrode de couverture, 3) un micromanipulateur, et 4) un électroporateur. Injections d’ADN focal Préparer un mélange d’ADN de vecteurs d’expression : pCAGGs-IRES-GFP (vector de contrôle) – pCAGGs-hM3D(Gq)-IRES-RFP, à une concentration de 1 g/L pour chaque vecteur et ajouter une solution verte rapide (stock 25 mg/mL) dans une dilution de 1/10. Remplir une micropipette en verre tiré (0,5 mm de diamètre intérieur et 1 mm de diamètre externe) avec 10 l du mélange d’ADN et injecter de petites quantités (sur la plage de 25-50 nL) dans la région sélectionnée (MGE/CGE) de la tranche (figure1 et figure 2). Électroporation aigueREMARQUE: L’électroporation doit être effectuée immédiatement après l’injection d’ADN focal. Placez le petit bloc d’agarose sur l’électrode de boîte De Petri et attachez la colonne d’agarose à l’électrode de couverture mobile à l’aide d’une micro-spatule à plat. Transférer la tranche avec sa membrane de soutien sur le bloc d’agarose et placer l’électrode supérieure avec la colonne d’agarose au-dessus de la région sélectionnée (MGE/CGE) de la tranche.REMARQUE : Les tensions de charge de 125 V (deux impulsions de 5 ms chacune, intervalle 500 ms) donneront une électroporation réussie (figure 3). Après l’électroporation, placer la tranche avec sa membrane de soutien dans le plat et transférer le plat dans un incubateur de culture tissulaire CO 2, à 37 oC. Après 1 h, échangez le milieu MEM contre un milieu de base approprié aux cultures neuronales primaires (milieu de base neuronal ; Tableau 1) et incuber les tranches pendant la nuit, pendant environ 18-24 h. 3. Préparation des greffes de cellules Vérifiez l’efficacité de l’électroporation dans toutes les tranches. Sélectionnez uniquement les tranches où un nombre acceptable de cellules fluorescentes est observée (Figure 3).REMARQUE: Électropoler environ 30 tranches/par expérience afin d’acquérir le nombre approprié de cellules pour la greffe (voir ci-dessous). Disséquer la région sélectionnée (MGE/CGE) de chaque tranche et couper le tissu en petits morceaux dans la solution froide de Krebs, sous un stéréo-microscope fluorescent de dissection. Pendant ce temps, placez un tube de 1,5 ml avec un milieu de base neuronal de 900 l dans un bain d’eau à 37 oC. Transférer les morceaux de tissu avec un micropipettor P1000 dans un tube de 1,5 ml contenant 500 l de milieu L15/DNase préparé en ajoutant 100 ‘L de 1 mg/mL de stock de DNase dans le milieu DMEM/F12 en 900 ‘L de milieu L15. Laver les morceaux de tissu en tapant. Ajouter 100 l de DNase (stock de 1 mg/mL dans le milieu DMEM/F12) dans le milieu de base du neurone de 900 l. Jetez le milieu L15/DNase et suspendez les morceaux de tissu dans le milieu de base/DNase de neurone de 200 L préparé à l’étape 3.5. Placez un micropipettor P200 à 180 l et dissociez mécaniquement les morceaux de tissu en faisant monter et descendre doucement, 20-30 fois, jusqu’à ce qu’une suspension lisse et « crémeuse » soit obtenue. Ajouter 200 l de milieu de base/DNase neuronal (volume total final de 400 l) et resuspendre. Prenez un aliquot de 4 L de cellules, diluez-vous convenablement et montez sur un hémocytomètre. Sous un microscope de champ lumineux, vérifiez l’efficacité de la dissociation et comptez le nombre de cellules.REMARQUE: Si la dissociation est réussie, des cellules simples brillantes (vivantes) et non des agrégats cellulaires seront observés. Suspension de cellules centrifugeuses de l’étape 3.8, à 1.000 tr/min, à RT, pendant 5 min, et par la suite, retirez le supernatant du tube et ajoutez le milieu l15/DNase approprié (habituellement 5-7 -L) de sorte que la concentration finale des cellules sera 8 x 105-1.2 x 106 cellules/L.REMARQUE: Pendant la suspension, il est extrêmement important d’éviter les bulles d’air. Placez l’aliquot cellulaire sur la glace et ayez un milieu L15/DNase supplémentaire pour les injections. 4. Injections intracrâniennes REMARQUE: Les procédures suivantes ont lieu dans une salle de procédure au sein de l’établissement Animal House. Puisque les cellules seront injectées directement au cerveau des chiots nouveau-nés sans exposer le cerveau, les conditions aseptiques sont maintenues en stérilisant l’espace de travail avec la solution EtOH de 70% et en utilisant des aiguilles en verre autoclaved. L’équipement suivant est nécessaire pour les injections intracrâniennes : 1) un stéréo-microscope de dissection de champ lumineux, 2) un micro-injecteur, et 3) un coussin chauffant pour la récupération de souris. Préparer une aiguille en verre en tirant les aiguilles selon les recommandations du fabricant. Des aiguilles en verre d’un diamètre extérieur de 80 m, d’un diamètre intérieur de 40 m et d’un bevel de 30 degrés sont utilisées dans ce protocole.REMARQUE: Comme mentionné ci-dessus, les aiguilles doivent être autoclaved avant utilisation. Remblayez manuellement l’aiguille à l’aide d’huile biologiquement inerte à l’aide d’une aiguille de 30 G, 2 pouces et d’une seringue. Assembler et insérer l’aiguille à l’unité d’injection selon les instructions du fabricant. Déterminer les paramètres d’injection à un volume maximal (69 nL) et un taux relativement lent (23 nL/s). Vider l’aiguille jusqu’à ce que le piston soit complètement étendu. Remplissez l’aiguille. Couper un petit morceau d’un ruban greffé et le placer sous un champ lumineux dissection stéréo-microscope. À l’arme p. 10, transférer 5 ll de l’échantillon (aliquot cellulaire) sur la bande, de sorte qu’une goutte sphérique se forme. Placez la pointe de l’aiguille dans l’échantillon et remplissez l’aiguille (le piston se rétracte et dessine l’échantillon avec lui).REMARQUE: Puisque l’échantillon doit être assez visqueux, remplissez l’aiguille en petits pas de sorte que l’échantillon sera équilibrant, et à un rythme lent qui empêche les bulles de se former. L’échantillon doit être lisse et homogène à l’intérieur de l’aiguille. Si l’échantillon est trop visqueux et qu’il n’est pas possible de remplir l’aiguille, ajoutez autant de milieu L15/DNase qu’il est nécessaire pour obtenir la viscosité correcte. Néanmoins, cela va changer la concentration de l’échantillon, et idéalement devrait être évitée. Anesthésier les nouveaux-nés (jour postnatal 0-2 [P0-P2]) sur la glace pendant 2-5 min.REMARQUE: Assurez-vous que le chiot ne bouge pas. Placez le chiot anesthésié sous le microscope stéréo-microscope de dissection de champ lumineux. Effectuez 3-4 injections de 69 nL chacune dans chaque hémisphère.REMARQUE: Les sites d’injection sont situés à environ 1 mm latéralement à la ligne médiane, et entre 1 mm caudal à bregma et 1 mm rostral à la ligne interaurale. L’extrémité de l’aiguille doit être placée à environ 1 mm de profondeur à la surface du pial. Après chaque injection, l’aiguille est laissée en place pendant environ 30 s et retirée par périodes. Immédiatement après les injections, placer le chiot sur un coussin chauffant avec le chauffage à son réglage le plus bas (37 oC). Lorsque le chiot récupère, transférez-le dans la cage avec sa mère.REMARQUE: Ne laissez jamais la mère sans chiots dans la cage. L’ensemble de la procédure (de retirer le chiot de ses compagnons de litière, jusqu’à ce qu’il soit retourné) devrait durer moins de 10 min. 5. Injections de clozapine-N-oxyde Préparer la solution de stock DREADD ligand, CNO en diluant 1 mg de CNO dans 50 L de sulfoxide de diméthyle (DMSO) jusqu’à ce que la solution soit translucide. Recharger jusqu’à 10 ml avec de la solution saline de sorte que la concentration finale de CNO soit de 0,1 mg/mL.REMARQUE: DMSO est toxique. Évitez de l’utiliser à une concentration supérieure à 0,1%. Utilisez comme contrôle une solution saline contenant la même concentration DMSO que la solution contenant CNO. À partir du jour postnatal 14 et pendant 3 jours constitutifs (P14-P16), dans chaque souris exécutent deux injections intrapéritonéales (I.P.) de CNO (concentration de CNO : 1 mg/kg) ou 0,05% DMSO dans saline, par jour, 12 h de distance. Le dernier jour (P17), effectuer une seule injection et sacrifier les souris par luxation cervicale dans une fenêtre de temps de 30 min-1 h.