化学遺伝子解析で作られた皮質間ニューロン前駆体を早期産後マウス脳に移植

動物は、英国動物法(科学的手続き)法(1986年)に従って飼育され、飼育された。 注:pCAGGs-hM3D(Gq)-IRES-RFPコンストラクトの生成のために、hM3D(Gq)配列を含むSalI-StuIフラグメントはプラスミド50463(Addgene)から単離され、発現ベクターpCAGG-RFP(F.ギルモットからの贈り物)に挿入された。XhoI-エコルフ 1. マウス胚皮質スライスの調製 適切な洗剤溶媒および70%エタノール(EtOH)溶液(H2O)でラボ機器(例えば、ステレオ顕微鏡)および表面(例えば、ベンチ)を殺菌する。 オートクレーブされた解剖ツールを使用し、常に100%EtOHに保管してください。 1xリン酸緩衝液(PBS)で4%低ゲル化温度アガロースの20mLアリコートを3本、50mLチューブで準備し、55°Cに保ちます。 妊娠13.5または14.5日の子宮頸部脱臼による妊娠マウスの犠牲(胚の日E13.5-E14.5)。 解剖はさみで、妊娠中のマウスの腹部を開き、子宮角(胚と共に)を取り出し、90mmのペトリ皿に氷冷クレブス溶液(表1)に入れます。 まっすぐな学生の細かい鉗子のペアで、膜下嚢を開き、胚を取り除き、新鮮な氷冷クレブス溶液でそれらを移し、新しい90mmペトリ皿で。マウスの胚の脳(前脳、中脳、後頭脳)を胚体の残りの部分から解剖する。 後頭脳から解剖した脳を保持し、新しい90ミリメートルペトリ皿で氷冷クレブス溶液でそれらを転送し、氷の上にそれらを維持します。 防水ペンで、6つの35ミリメートルペトリ皿の底部の中央に、外面に直線を描きます。 1 4%低ゲル化アガローズ/PBS 20 mLアリコートを37°Cで5分間置き、その直後に35mmペトリ皿2個に10mLを入れ、解剖した脳を埋め込みます。注:嗅球は下向き(ペトリ皿の底)に向かう必要があります。ペトリ皿ごとに3-4の脳を埋め込み、以前に描かれた直線でそれらを整列させる。2 つの脳の間に 3-5 mm のスペースを残します。 解剖されたすべての脳が埋め込まれるまで、手順 1.8 と 1.9 を繰り返します。 埋め込まれた脳を4°Cに置き、アガロースが固化するために、その後、適切なサイズと向きの単一のブロックに3つの脳を彫刻します。注:脳サンプルの縁の周りに約3ミリメートルを残します。嗅球を上部にして、脳の向きを変更します。 マイクロトームベースの表面にブロックを接着し、外科ブレードを使用して、ブロックの底部を通して、各2つの脳の間で、3つの独立したブロック(1つの脳を含む各ミニブロック)を作成します。 ブロックを、氷冷クレブス溶液で、振動ブレードマイクロトームを使用して、250 μm厚いスライスに切断します。 平らに編んだ平らなマイクロへらは、中間または卵性神経節のエミネを含むスライスのみを収集します(MGEまたはCGE;図1)ポリスチレンセンターウェル臓器培養皿(60mm x 15 mm)で、フィルター膜(直径13μm、細孔サイズ8.0μm)に個別に移し、最小必須媒体(MEM、表1)に浮遊します。 料理をCO2組織培養インキュベーターに置き、37°C、1時間、焦点電ポレーションを準備します。 2. 急性脳スライスエレクトロポレーション エレクトロポレーション手順を開始する前に、100mmペトリ皿に1%アガロースゲルの50 mLを調調します。アガロースゲルを室温(RT)で約30分間固化させます。 小さなアガロースカラム(直径1mm、長さ10mm)を準備し、ガラスピペット(225mmの長さ、2mL容量)でパンチし、氷冷クレブス溶液でそれらを転送します。注:2 mLピペットに適したゴム製ドロッパー電球をピペットに取り付け、それを押すことでガラスピペットからクレブス溶液にカラムを放出することができます。 外科ブレードを使用して、電極の表面に収まる小さなアガロースブロック(下記参照)と、脳スライスへの焦点DNA注射を行うためのベースとして使用される大きなアガローゼブロックをカットします。同様に氷冷クレブス溶液でアガロースブロックを転送します。 焦点注射と急性エレクトロポレーションのセットアップを準備します (図2)。注:注射には、1)明視野解剖ステレオ顕微鏡、2)空気ピコポンプインジェクター、3)マイクロマニピュレータ、4)磁気スタンド、5)鋼ベースプレートが必要です。急性スライスエレクトロポレーションには、1)1つの正方形白金10mmペトリ皿電極、2)1つの正方形白金10mmカバー電極、3)マイクロマニピュレータ、および4)エレクトロポレータが必要です。 フォーカルDNA注射 発現ベクターのDNA混合物を調製する:pCAGGs-IRES-GFP(対照ベクター)+pCAGGs-hM3D(Gq)-IRES-RFPを、各ベクターに対して1μg/μLの濃度で調製し、1/10希釈で高速緑色溶液(ストック25mg/mL)を添加する。 引っ張られたガラスマイクロピペット(内径0.5mm、外径1mm)をDNA混合物の10μLで充填し、スライスの選択領域(MGE/CGE)に少量(25~50nLの範囲)を注入します(図1および図2)。 急性エレクトロポレーション注:エレクトロポレーションは、焦点DNA注射の直後に行われるべきである。 ペトリ皿電極に小さなアガロースブロックを置き、フラットエンドのマイクロへらの助けを借りて、モバイルカバー電極にアガロースカラムを取り付けます。 支持膜を持つスライスをアガロースブロックに移し、スライスの選択した領域(MGE/CGE)の上にアガロースカラムを付けて上部電極を配置します。注:125Vの充電電圧(それぞれ5ミリ秒の2パルス、間隔500ミリ秒)は、エレクトロポレーションに成功します(図3)。 エレクトロポレーションの後、スライスを支持膜で皿に入れ、37°CでCO2組織培養インキュベーターに皿を移します。 1時間後、一次神経培養に適した基礎培地(ニューロン塩基性培地;表 1)約18〜24時間、一晩スライスをインキュベートします。 3. 細胞移植片の調製 すべてのスライスのエレクトロポレーションの効率を確認します。許容数の蛍光細胞が観察されるスライスのみを選択します(図3)。注:移植のための適切な数の細胞を獲得するために、実験ごとに約30スライス/実験を電気的にする(下記参照)。 各スライスから選択した領域(MGE/CGE)を解剖し、蛍光解剖ステレオ顕微鏡下で氷冷クレブス溶液中の小片に組織を切断します。 一方、900 μLニューロン基本培地を含む1.5mLチューブを37°Cの水浴に入れます。 P1000マイクロピペットを使用して組織片を、DMEM/F12培地に1mg/mL DNaseストックの100μLをL15培地の900μLに加えて調製したL15/DNase培地の500μLを含む1.5mLチューブに移します。ティッシュピースをタップして洗います。 900 μL ニューロン基本培地に DNase の 100 μL (DMEM/F12 培地のストック 1 mg/mL) を追加します。 L15/DNase培地を廃棄し、ステップ3.5で調製した200 μLニューロン基本/DNase培地で組織片を再懸濁します。 P200マイクロピペットを180μLに設定し、滑らかで「クリーミー」な懸濁液が得られるまで、20~30回、ゆっくりと上下にピペッティングして組織片を機械的に解離します。 ニューロン基本/DNase培地(最終総体積400μL)の200 μLを追加し、再中断します。 細胞の4 μLアリコートを取り、適切に希釈し、血球計に取り付けます。 明るい視野顕微鏡の下で、解離の効率を確認し、細胞の数を数えます。注:解離が成功した場合、明るい(生きている)単一の細胞と細胞凝集体が観察されます。 ステップ3.8からの遠心分離細胞懸濁液は、1,000 rpmで、RTで、5分間、その後、チューブから上清を取り出し、適切なL15/DNase培地(通常は5-7 μL)を加えて、細胞の最終的な濃度が8 x 105-1.2 x 10 6になります。セル/μL。注:再停止中は、気泡を避けることは非常に重要です。 氷の上にセルアリコートを置き、注射のための追加のL15/DNase培地を持っています。 4. 頭蓋内注射 注:以下の手続きは、アニマルハウス施設内の手続き室で行われます。細胞は脳を露出させることなく新生児の子犬の脳に直接注入されるので、無菌状態は70%EtOH溶液で作業スペースを殺菌し、オートクレーブガラス針を使用することによって保たれます。頭蓋内注射には、1)明視野解剖ステレオ顕微鏡、2)マイクロインジェクター、3)マウス回復用の加熱パッドが必要です。 製造業者の推薦に従って針を引っ張ることによってガラスの針を準備する。このプロトコルでは、外径80μm、内径40μm、ベベル30°ベベルを備えたガラス針を使用しています。注:前述のように、針は使用前にオートクレーブする必要があります。 30G、2インチの針と注射器を使用して、生物学的に不活性な油で針を手動でバックフィルします。 製造元の指示に従って、インジェクタユニットに針を組み立てて挿入します。 最大音量(69 nL)と相対低速(23 nL/s)で射出設定を決定します。 プランジャーが完全に伸びるまで針を空にします。 針を満たして 移植テープから小片を切り取り、明るい視野解剖ステレオ顕微鏡の下に置きます。P10マイクロピペットを使用して、サンプル(セルアリコート)から5μLをテープに移し、球状のドロップが形成されます。 サンプルに針の先端を置き、針を埋めます(プランジャーは引き込み、それにサンプルを引き出します)。注:サンプルは非常に粘性である必要がありますので、サンプルが平衡化し、気泡が形成されるのを防ぐ遅い速度で、小さなステップで針を埋めます。サンプルは針の中で滑らかで均質でなければならない。サンプルが粘性が高すぎて針を満たすることができない場合は、正しい粘度を得るために必要なL15/DNase培地を多く加えます。それにもかかわらず、これはサンプルの濃度を変更し、理想的には避けるべきです。 生まれたばかりの子犬(生後0-2[P0-P2])を氷上で2~5分間麻酔する。注:子犬が動いていないことを確認してください。 明視野解剖ステレオ顕微鏡の下に麻酔された子犬を置きます。 各半球でそれぞれ69 nLの3-4注射を行います。注:注射部位は、中線に約1mm横に位置し、1mmの風下からブレグマまで、1mmのロストラル間に位置する。針の先端は、約1mmの深さの槍の表面に配置する必要があります。各注射の後、針は約30sの所定の位置に残され、期間内に引き抜かれる。 注射の直後に、その最も低い設定(37 °C)で加熱と加熱パッドに子犬を置きます。子犬が回復すると、母親と一緒にケージに転送します。注:おかごの中に子犬を置いておかないでお母さん。全体の手順(そのごみから子犬を取り除くことから、それが返されるまで)は10分未満続くべきです。 5. クロザピン-N酸化物注射 DREADDリガンド、CNOストック溶液を50μLのジメチルスルホキシド(DMSO)で1mg希釈してCNOストック溶液を半透明になるまで調記する。CNOの最終的な濃度が0.1 mg/mLであることを生理生理物で10 mLまでトップアップ。注:DMSOは有毒だ0.1%より高い濃度にそれを使用することは避けてください。CNO含有溶液と同じDMSO濃度を含む生理生理生理物溶液を制御として使用する。 出生後14日目および3日間(P14-P16)から、各マウスでCNO(CNO濃度:1mg/kg)または0.05%DMSOの2回の経皮内注射(CNO濃度:1mg/kg)または0.05%DMSOを1日あたり、12h離れて行う。 最終日(P17)に、30分1時間の時間枠内で頸部脱臼による単回注射及び犠牲マウスを行う。