Transplantation von chemogenetisch hergestellten kortikalen Interneureuren in frühpostnatale Maushirne

Die Tiere wurden gemäß dem United Kingdom Animals (Scientific Procedures) Act (1986) gezüchtet und untergebracht. HINWEIS: Für die Erzeugung des pCAGGs-hM3D(Gq)-IRES-RFP-Konstrukts wurde ein SalI-StuI-Fragment, das die hM3D(Gq)-Sequenz enthält, aus dem Plasmid 50463 (Addgene) isoliert und in den Expressionsvektor pCAGGs-RFP (Geschenk von F. Guillemot) eingefügt, der mit XhoI-EcoRV. 1. Herstellung von Maus Embryo kortikalen Scheiben Sterilisieren Sie Laborgeräte (z.B. Stereomikroskope) und Oberflächen (z.B. Bänke) mit einem geeigneten Waschmittellösungsmittel und 70% Ethanol (EtOH) Lösung in Wasser (H2O). Verwenden Sie Sezierwerkzeuge, die autoklaviert wurden, und halten Sie sie die ganze Zeit in 100% EtOH. Bereiten Sie drei 20 ml Aliquots mit 4% Niedriggeliertemperatur-Agarose in 1x Phosphatpufferlösung (PBS) in 50 ml-Röhrchen vor und halten Sie sie bei 55 °C. Opfern Sie trächtige Mäuse durch Zervixdislokation bei 13,5 oder 14,5 Tagen Der Trächtigkeit (Embryonaltag E13.5-E14.5). Mit einer Sezierschere den Bauch der trächtigen Mäuse öffnen, die Gebärmutterhörner (mit den Embryonen) entfernen und in eiskalte Krebslösung (Tabelle 1) in eine 90 mm Petrischale geben. Mit einem Paar geraden Student Feine Zange, öffnen Sie die Fruchtwassersäcke, entfernen Sie die Embryonen und übertragen Sie sie in frischen eiskalten Krebs-Lösung, in einer neuen 90 mm Petrischale. Sezieren Sie das Gehirn des Maus-Embryos (Vorhirn, Mittelhirn, Hinterhirn) vom Rest des Embryokörpers. Halten Sie die sezierten Gehirne aus dem Hinterhirn, übertragen Sie sie in eiskalter Krebs-Lösung in einer neuen 90 mm Petrischale und halten Sie sie auf Eis. Mit einem wasserdichten Stift, zeichnen Sie eine gerade Linie an der Außenfläche, in der Mitte des unteren Teils von sechs 35 mm Petri-Schalen. Legen Sie eine 4% niedriggegelende Agarose/PBS 20 ml aliquot bei 37 °C für 5 min. Unmittelbar danach arm 10 ml in zwei 35 mm Petrischalen und betten Sie die sezierten Gehirne ein.HINWEIS: Die olfaktorischen Glühbirnen sollten nach unten zeigen (unten in der Petrischale). 3-4 Gehirne pro Petrischale einbetten, richten Sie sie in der geraden Linie aus, die zuvor gezeichnet wurde. Lassen Sie 3 x 5 mm Abstand zwischen jedem zwei Gehirne. Wiederholen Sie die Schritte 1.8 und 1.9, bis alle sezierten Gehirne eingebettet sind. Stellen Sie die eingebetteten Gehirne auf 4 °C, damit sich die Agarose verfestigt, und schnitzen Sie die drei Gehirne anschließend in einen einzigen Block mit entsprechender Größe und Ausrichtung.HINWEIS: Lassen Sie ca. 3 mm an den Rändern der Hirnproben. Ändern Sie die Ausrichtung des Gehirns, mit den olfaktorischen Glühbirnen auf der Oberseite. Kleben Sie den Block auf der Oberfläche einer Mikrotom-Basis und mit einer chirurgischen Klinge geschnitten den ganzen Boden des Blocks, zwischen jedem zwei Gehirne, um 3 unabhängige Blöcke zu erstellen (jeder Mini-Block enthält ein Gehirn). Schneiden Sie die Blöcke in eiskalter Krebslösung in 250 m dicke Scheiben mit einem vibrierenden Klingenmikrotom. Mit einem gebogenen flachen Mikrospachtel sammeln nur die Scheiben, die die mediale oder kaudale ganglien Eminenzen (MGE oder CGE; Abbildung 1) und übertragen Sie sie einzeln auf Filtermembranen (13 m Durchmesser, 8,0 m Porengröße), schwebend auf minimalem essentiellen Medium (MEM, Tabelle 1) in Polystyrol-Mittelbrunnen-Orgelkultur-Gerichten (60 mm x 15 mm). Die Gerichte in einen CO2-Gewebekultur-Inkubator, bei 37 °C, für 1 h legen und für die fokale Elektroporation vorbereiten. 2. Akute Gehirnscheibe Elektroporation Vor Beginn des Elektroporationsverfahrens 50 ml 1% Agarosegel in einer 100 mm Petrischale zubereiten. Lassen Sie das Agarose-Gel bei Raumtemperatur (RT) ca. 30 min erstarren. Kleine Agarosesäulen (1 mm Durchmesser und 10 mm Länge), die mit einer Glaspipette (225 mm Länge; 2 ml Fassungsvermögen) gestanzt und in eiskalten Krebs-Lösungen übertragen werden, bereiten.HINWEIS: An der Pipette wird eine Gummi-Tropfenlampe befestigt, die für 2 ml Pipetten geeignet ist, und durch Drücken kann die Säule von der Glaspipette zur Krebs-Lösung freigegeben werden. Mit einer chirurgischen Klinge, schneiden Sie kleine Agarose Blöcke von zwei Größen: eine kleine, die auf die Oberfläche der Elektrode passen (siehe unten) und eine größere, die als Basis für die Durchführung der fokalen DNA-Injektionen in die Gehirnscheiben verwendet werden. Übertragen Sie die Agarose-Blöcke auch in eiskalte Krebs-Lösung. Bereiten Sie den Aufbau für die Fokalinjektionen und die akute Elektroporation vor (Abbildung 2).HINWEIS: Für die Injektionen wird folgende Ausrüstung benötigt: 1) ein Hellfeld-Sezier-Stereomikroskop, 2) ein pneumatischer Pico-Pumpen-Injektor, 3) ein Mikromanipulator, 4) ein magnetischer Ständer und 5) eine Stahlgrundplatte. Für die akute Scheibenelektroporation wird folgende Ausrüstung benötigt: 1) eine quadratische Platin 10 mm Petrischalenelektrode, 2) eine quadratische Platin 10 mm Deckelektrode, 3) ein Mikromanipulator und 4) ein Elektroporator. Fokale DNA-Injektionen Bereiten Sie eine DNA-Mischung von Expressionsvektoren vor: pCAGGs-IRES-GFP (Kontrollvektor) + pCAGGs-hM3D(Gq)-IRES-RFP, bei einer Konzentration von 1 g/l für jeden Vektor und fügen Sie eine schnelle grüne Lösung (Bestand 25 mg/ml) in einer Verdünnung von 1/10 hinzu. Füllen Sie eine gezogene Glasmikropipette (0,5 mm Innendurchmesser und 1 mm Außendurchmesser) mit 10 l des DNA-Gemischs und injizieren Sie kleine Mengen (im Bereich 25-50 nL) in den ausgewählten Bereich (MGE/CGE) der Scheibe (Abbildung1 und Abbildung 2). Akute ElektroporationHINWEIS: Die Elektroporation sollte unmittelbar nach der fokalen DNA-Injektion durchgeführt werden. Legen Sie den kleinen Agaroseblock auf die Petrischalenelektrode und befestigen Sie die Agarosesäule mit Hilfe einer flachen Mikrospachtel an der mobilen Deckelektrode. Übertragen Sie die Scheibe mit ihrer unterstützenden Membran auf den Agaroseblock und legen Sie die obere Elektrode mit der Agarosesäule auf die ausgewählte Region (MGE/CGE) der Scheibe.HINWEIS: Ladespannungen von 125 V (zwei Impulse von je 5 ms, Intervall 500 ms) ergeben eine erfolgreiche Elektroporation (Abbildung 3). Nach der Elektroporation die Scheibe mit ihrer unterstützenden Membran in die Schale geben und die Schale in einem CO2-Gewebekultur-Inkubator bei 37 °C übertragen. Nach 1 h, tauschen Sie das MEM-Medium gegen ein grundlegendes Medium, das für primäre neuronale Kulturen geeignet ist (Neuron-Basismedium; Tabelle 1) und inkubieren Sie die Scheiben über Nacht, für ca. 18-24 h. 3. Herstellung von Zelltransplantaten Überprüfen Sie die Effizienz der Elektroporation in allen Scheiben. Wählen Sie nur die Slices aus, in denen eine akzeptable Anzahl von Fluoreszenzzellen beobachtet wird (Abbildung 3).HINWEIS: Elektroporate ca. 30 Scheiben/pro Experiment, um die entsprechende Anzahl von Zellen für die Transplantation zu erhalten (siehe unten). Sezieren Sie die ausgewählte Region (MGE/CGE) aus jeder Scheibe und schneiden Sie das Gewebe in eiskalte Krebs-Lösung unter einem fluoreszierenden Dissektions-Stereomikroskop in kleine Stücke. In der Zwischenzeit legen Sie ein 1,5 ml-Rohr mit 900 l Neuron-Grundmedium in ein Wasserbad bei 37 °C. Übertragen Sie die Gewebestücke mit einem P1000 Mikropipettor in ein 1,5 ml-Rohr, das 500 l L15/DNase-Medium enthält, das durch Zugabe von 100 l von 1 mg/ml DNase-Bestand in DMEM/F12-Medium in 900 l L15 Medium hergestellt wird. Waschen Sie die Gewebeteile durch Tippen. Fügen Sie 100 l DNase (Lager 1 mg/ml in DMEM/F12 medium) in das 900-L-Neuron-Grundmedium ein. Entsorgen Sie das Medium L15/DNase und setzen Sie die in Schritt 3.5 hergestellten Gewebeteile in 200 L Neuron Basic/DNase Medium wieder ab. Stellen Sie einen P200-Mikropipettor auf 180 l und distanzieren Sie die Gewebeteile mechanisch, indem Sie 20-30-mal sanft nach oben und unten pfeifen, bis eine glatte und “cremige” Suspension erhalten ist. Fügen Sie 200 L Neuron Basic/DNase Medium (Endvolumen 400 l) hinzu und suspendieren. Nehmen Sie ein 4 L Aliquot von Zellen, verdünnen Sie richtig und montieren Sie auf einem Hämozytometer. Überprüfen Sie unter einem Lichtfeldmikroskop die Effizienz der Dissoziation und zählen Sie die Anzahl der Zellen.HINWEIS: Wenn die Dissoziation erfolgreich ist, werden helle (lebendige) Einzelzellen und keine Zellaggregate beobachtet. Zentrifugenzellsuspension ab Schritt 3.8, bei 1.000 U/min, bei RT, für 5 min, und anschließend den Überstand aus dem Rohr entfernen und das entsprechende L15/DNase-Medium (in der Regel 5-7 l) hinzufügen, so dass die Endkonzentration der Zellen 8 x 105-1,2 x 10 6 beträgt. Zellen/L.HINWEIS: Während der Resuspension ist es extrem wichtig, Luftblasen zu vermeiden. Legen Sie die Zelle aliquot auf Eis und haben zusätzliche L15/DNase Medium für die Injektionen. 4. Intrakranielle Injektionen HINWEIS: Die folgenden Verfahren finden in einem Verfahrensraum innerhalb der Tierhauseinrichtung statt. Da die Zellen direkt in das Gehirn von neugeborenen Welpen injiziert werden, ohne das Gehirn freizulegen, werden aseptische Bedingungen gehalten, indem der Arbeitsraum mit 70% EtOH-Lösung sterilisiert und autoklavierte Glasnadeln verwendet werden. Für die intrakraniellen Injektionen wird folgendes benötigt: 1) ein helles Feld-Sezier-Stereomikroskop, 2) ein Mikroinjektor und 3) ein Heizpad für die Mausrückgewinnung. Bereiten Sie eine Glasnadel vor, indem Sie Nadeln gemäß den Empfehlungen des Herstellers ziehen. In diesem Protokoll werden Glasnadeln mit einem Außendurchmesser von 80 m, einem Innendurchmesser von 40 m und einer 30°-Abschrägung verwendet.HINWEIS: Wie oben erwähnt, sollten Nadeln vor der Verwendung autoklaviert werden. Die Nadel mit einer 30 G, 2 Zoll Nadel und einer Spritze manuell mit biologisch inertem Öl verfüllen. Montieren und setzen Sie die Nadel gemäß den Anweisungen des Herstellers an die Injektoreinheit ein. Bestimmen Sie die Injektionseinstellungen bei maximalem Volumen (69 nL) und einer relativ langsamen Rate (23 nL/s). Entleeren Sie die Nadel, bis der Kolben vollständig verlängert ist. Füllen Sie die Nadel. Schneiden Sie ein kleines Stück von einem Pfropfband und legen Sie es unter ein helles Feld-Sezieren Stereo-Mikroskop. Mit einer P10-Mikropipette 5 l von der Probe (Zell-Aliquot) auf das Band übertragen, so dass ein kugelförmiger Tropfen gebildet wird. Legen Sie die Spitze der Nadel in die Probe und füllen Sie die Nadel (der Kolben zieht sich zurück und zieht die Probe mit).HINWEIS: Da die Probe recht zähflüssig sein sollte, füllen Sie die Nadel in kleinen Schritten, damit die Probe ausglich, und mit einer langsamen Rate, die verhindert, dass sich Blasen bilden. Die Probe sollte in der Nadel glatt und homogen sein. Wenn die Probe zu zähflüssig ist und es nicht möglich ist, die Nadel zu füllen, fügen Sie so viel L15/DNase Medium hinzu, wie erforderlich ist, um die richtige Viskosität zu erhalten. Dies wird jedoch die Konzentration der Probe verändern und sollte idealerweise vermieden werden. Anästhetisieren Sie neugeborene Welpen (postnataler Tag 0-2 [P0-P2]) auf Eis für 2-5 min.HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass sich der Welpen nicht bewegt. Platzieren Sie den anästhesierten Welpen unter das helle Feld-Sezier-Stereomikroskop. Führen Sie 3-4 Injektionen von je 69 nL in jeder Hemisphäre durch.HINWEIS: Die Injektionsstellen befinden sich ca. 1 mm seitlich zur Mittellinie und zwischen 1 mm kaudal bis bregma und 1 mm rostral zur interauralen Linie. Die Spitze der Nadel sollte ca. 1 mm tief auf die Pialoberfläche gelegt werden. Nach jeder Injektion wird die Nadel ca. 30 s an Ort und Stelle gelassen und in Zeiträumen zurückgezogen. Legen Sie den Welpen unmittelbar nach der Einspritzung auf ein Heizkissen mit der Heizung auf der niedrigsten Einstellung (37 °C). Wenn der Welpen sich erholt, überträgt er ihn mit seiner Mutter in den Käfig.HINWEIS: Lassen Sie die Mutter niemals ohne Welpen im Käfig. Das gesamte Verfahren (vom Entfernen des Welpen aus seinen Wurfmatten, bis es zurückgegeben wird) sollte weniger als 10 min dauern. 5. Clozapin-N-Oxid-Injektionen Bereiten Sie die DREADD Ligand, CNO-Lagerlösung durch Verdünnung von 1 mg CNO in 50 l Dimethylsulfoxid (DMSO) vor, bis die Lösung durchscheinend ist. Aufladen auf 10 ml mit Kochsaline, so dass die endendgültige CNO-Konzentration 0,1 mg/ml beträgt.HINWEIS: DMSO ist giftig. Vermeiden Sie es mit einer Konzentration von mehr als 0,1%. Verwenden Sie als Kontrolle eine Salinelösung, die die gleiche DMSO-Konzentration wie die CNO-haltige Lösung enthält. Ab dem postnatalen Tag 14 und für 3 konstitutive Tage (P14-P16) führen Sie in jeder Maus zwei intraperitoneale (I.P.) Injektionen von CNO (CNO-Konzentration: 1 mg/kg) oder 0,05% DMSO in der Saline, pro Tag, 12 h auseinander durch. Führen Sie am letzten Tag (P17) eine einzelne Injektion durch und opfern Sie Mäuse durch Zervixdislokation innerhalb eines Zeitfensters von 30 min-1 h.