زرع الذرية القشرية الهندسية كيميائياً في عقول الفئران المبكرة بعد الولادة
Summary
هنا نقدم بروتوكول، مصممة لاستخدام الأدوات الكيميائية الوراثية للتعامل مع نشاط الذرية القشرية بين الخلايا العصبية المزروعة في قشرة الفئران في وقت مبكر بعد الولادة.
Abstract
يتم تنظيم تطوير الخلايا العصبية من خلال مزيج معقد من العوامل البيئية والوراثية. تقييم المساهمة النسبية لكل مكون مهمة معقدة، والتي من الصعب بشكل خاص فيما يتعلق بتطوير حمض غاما أمينوبوتيريك (غابا) الخلايا القشرية التحسسية (CIs). CIs هي الخلايا العصبية المثبطة الرئيسية في القشرة الدماغية، وأنها تلعب أدوارا رئيسية في الشبكات العصبية، من خلال تنظيم كل من نشاط الخلايا العصبية الهرمية الفردية، فضلا عن السلوك المذبذب للفرق العصبية. وهي تتولد في هياكل جنينية عابرة (الوسائط المتوسطة والعقدية الصدغية – MGE وCGE) التي يصعب جداً استهدافها بكفاءة باستخدامها في نُهُج التهريج الرحمي. يهاجر الذريون بين الخلايا العصبية لمسافات طويلة أثناء النمو الجنيني الطبيعي، قبل أن يندمجوا في الدائرة القشرية. هذه القدرة الرائعة على تفريق والاندماج في شبكة النامية يمكن أن اختطفت عن طريق زرع السلائف بين الخلايا العصبية الجنينية في القشرية المضيفة في وقت مبكر بعد الولادة. هنا، نقدم بروتوكول يسمح بالتعديل الجيني للذرية بين الخلايا العصبية الجنينية باستخدام الكهربة البؤرية في الجسم الحي. ثم يتم زرع هذه السلائف بين الخلايا العصبية المهندسة في القشرية المضيفة في وقت مبكر بعد الولادة، حيث أنها سوف تنضج في CIs يمكن التعرف عليها بسهولة. يسمح هذا البروتوكول باستخدام أدوات متعددة مشفرة وراثيا، أو القدرة على تنظيم التعبير عن جينات محددة في الذرية بين الخلايا العصبية، من أجل التحقيق في تأثير المتغيرات الوراثية أو البيئية على النضج و دمج CIs.
Introduction
وظيفة الشبكات العصبية تعتمد في وجود تكملة متوازنة من الخلايا العصبية الإسقاط المحفزة والخلايا العصبية المثبطة. على الرغم من أن الخلايا العصبية القشرية (CIs) تمثل فقط 20٪ من جميع الخلايا العصبية في القشريات الثدييات، ويعتقد أن العجز في عددها أو وظيفتها تلعب دورا رئيسيا في مسببات الأمراض من اضطرابات النمو العصبي1،2. دراسة تطوير CI هو التحدي لأن يتم إنشاء CIs في الهياكل الجنينية العابرة التي يصعب الوصول إليها، وأنها تتبع هجرة عرضية طويلة قبل أن تصل إلى باليوم وتطوير ناضجة التشريحية والفسيولوجية 3. ومن المعروف أن الآليات الوراثية والبيئية على حد سواء التي تنظم تطوير CI4، ولكن ثبت أنه من الصعب دراسة المساهمة النسبية لعوامل متعددة.
تم الحصول على العديد من الأفكار في تطوير CI باستخدام أنظمة الثقافة في المختبر بعد عزل الذرية من البروز العقدية5،6. واحدة من المزايا الكبيرة لهذه الأساليب هي القدرة على تسمية وتعديل وراثيا الذرية المعزولة واتباع تمايزها بالتفصيل، للكشف عن التغيرات الخلية المستقلة. ومع ذلك، هذه الطرق غير قادرة على تقديم معلومات بشأن التفاعلات بين الخلايا العصبية النامية وشبكة نشطة. لقد قمنا بتكييف هذه البروتوكولات، عن طريق زرع السلائف المعدلة في القشرة المبكرة بعد الولادة. الذرية بين الخلايا العصبية معزولة عن البروزات العقدية الجنينية قادرة على البقاء على قيد الحياة، تفريق والاندماج في الشبكة المضيفة عند زرع في القشرة7،8. وقد استخدمت هذه الطريقة للحد من شدة النوبات الصرعية في نماذج الماوس الوراثية، واقترح كعلاج جديد ممكن لمختلف اضطرابات النمو العصبي9،10. يصف بروتوكول سابق إجراء لتبديل هذه السلائف مع ناقلات الفيروسية قبل زرع11. البروتوكول الذي نصفه هنا يسمح أيضا التعديل الجيني للخلايا العصبية البينية، ولكن لا يتطلب إنشاء ناقلات الفيروسية، التي تتطلب فقط الحمض النووي بلازميد، مما يزيد كثيرا من مرونته. وأفادت بعض الدراسات النجاح في استخدام في الكهربائي الرحم لتعديل وراثيا الذرية بين الخلايا العصبية في سماحة العقدية الكليلة (CGE)12, ولكن هذه الطريقة قد ثبت من الصعب جدا أن تتكاثر.
في قسم النتائج التمثيلية، نقوم بتوضيح استخدام هذه الطريقة للتعبير عن مستقبلات المصمم التي يتم تنشيطها حصريًا من قبل أدوية المصمم (DREADDs13)في CIs المزروعة، وهي طريقة استخدمناها في منشور حديث14. عبرنا عن hM3D (Gq)، مستقبلات هندسية على أساس مستقبلات الكولين الإنسان CHRM3، والتي لا تؤثر على وظيفة الخلايا العصبية إلا إذا كان يربط لها كلوزابين-N-أكسيد (CNO). إدارة CNO بشكل انتقائي مشغلات تنشيط hM3D (Gq) التعبير عن الخلايا. استخدمنا هذه الطريقة لإظهار أن الخلية المستقلة وعابرة إزالة الاستقطاب يكفي لمنع المبرمج من CIs أثناء التنمية14. جنبا إلى جنب مع أدوات مختلفة مشفرة وراثيا، وهذا البروتوكول لديه القدرة على أعلى أو أسفل تنظيم التعبير الجيني، وتصور أو التلاعب نشاط الخلية خلال مراحل مختلفة من التمايز بين الخلايا العصبية.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا نقوم بوصف منهجية يمكن الوصول إليها على نطاق واسع لتعديل وراثيا نشاط السلائف CI لدراسة تأثير النشاط الجوهري على نضج CI، و / أو تأثير النشاط المغيرC على الجمعية / وظيفة القشرية المتكاملة الدوائر.
في الماضي، العديد من المختبرات، بما في ذلك لنا، قد أجريت في تجارب الكهربائي الرحم من أجل تعديل وراثيا الخلايا العصبية الإسقاط6. ومع ذلك، في الكهرباء الرحم في سماحة العقدية التي تشمل ذرية CI من الصعب جدا، وذلك بسبب مشاكل مسار التوصيل الكهربائي. من أجل حل هذه المشكلة، يقوم عدد قليل من المختبرات بإجراء الحقن الموجهة بالموجات فوق الصوتية تليها الكهربائي، وهي تقنية شاقة تتطلب معدات باهظة الثمن. ويوفر هذا البروتوكول بديلاً لهذه المنهجيات التي يمكن لغالبية الأوساط العلمية الوصول إليها.
أحد الجوانب الأكثر تحديا من هذا البروتوكول هو تعظيم عدد الخلايا التي البقاء على قيد الحياة في القشرة المضيفة إلى مراحل ناضجة، عندما يتم عادة إجراء التحليل phenotypic (تعتمد جدا على تصميم التجربة، ولكن عادة أقدم من P17). هناك ثلاث خطوات رئيسية يجب على المحقق أن تولي اهتماما: (1) كفاءة الكهربائي. ويمكن تعظيم هذا عن طريق ضمان نقاء بلازميدات الحمض النووي. فقط عالية الجودة بلازميدات الحمض النووي (نسبةA 260/ A280 من 1.9-2.0) ينبغي أن تستخدم لهذا الإجراء. نحصل على مثل هذه الاستعدادات عالية الجودة الحمض النووي عن طريق استخدام تنقية الحمض النووي كلوريد السيزيوم. وثمة عامل حاسم آخر هو المروج الذي يدفع إلى التعبير عن جين الاهتمام. وجدنا أن ناقلات pCAGGs, الذي يتكون من الدجاج ب-أكتين المروج, قوية للغاية ويمكن أن تزيد بشكل كبير من كفاءة الكهربائي. (2) عدد الأجنة المانحة الأولية. من المهم التأكد من أن عددا كبيرا (12-16) من الأجنة من نفس المرحلة هي الكهربائي. ويمكن زيادة هذا العدد، إذا كان المزيد من التجارب يقومون بتشريح الأجنة وتشريحها معا، حيث أنه من المهم الحصول على شرائح القشرية الجنينية، والكهربائي ونقلها إلى الحاضنة في أقرب وقت ممكن. (3) من المهم التأكد من أن يتم حقن عدد كبير من الخلايا في كل جرو لضمان فرصة عالية للبقاء على قيد الحياة الخلية المزروعة حتى مراحل ناضجة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن هذا سيحسن بشكل كبير من احتمال نجاح عمليات زرع الأعضاء لأن الاستعدادات للخلايا ذات الكثافة المنخفضة ستؤدي إلى خلط غير متساو للخلايا مع الوسط، مما سيؤدي إلى تباين كبير في العقول المزروعة15 .
وقد صُمم البروتوكول الموصوف هنا للتحقيق في دور النشاط في تنظيم بقاء السي آي بطريقة مستقلة عن الخلايا. تم اختيار النافذة الزمنية P14-P17 لأداء حقن CNO على وجه التحديد وفقا للبيانات المنشورة، والتي تبين أن ذروة موت الخلايا CELL CELL cell s المزروعة يحدث خلال هذه الفترة16. ولذلك، فإن هذا الإطار الزمني أو تواتر حقن CNO قد لا ينطبق على أنواع الخلايا الأخرى أو مناطق الدماغ، ويجب على المحقق ضبط هذه المعلمات وفقا للأغراض التجريبية المحددة. وأخيراً، فإن المنهجية الموصوفة هنا للحقن داخل الجمجمة من CIs غير ممكنة إلا للجراء P0-P5 (اعتماداً أيضاً على خلفية خط الماوس). من حيث المبدأ، فإن أي حقن أكثر من P5 تتطلب ترقق أو إزالة الجمجمة15.
وتتمثل إحدى المزايا الرئيسية لهذا البروتوكول في القدرة على استخدام أدوات جديدة مرمزة وراثياً لتصور أو التلاعب بنشاط الـ CIs خلال مراحل مختلفة من التمايز أثناء اندماجها في شبكة نامية. مع وتيرة اكتشاف أجهزة استشعار جديدة للجهد وأجهزة استشعار الكالسيوم المشفرة وراثياً، فضلاً عن أدوات جديدة للجينات الكيميائية والوراثية البصرية، يسمح هذا البروتوكول للباحثين باستخدامها في غضون أسابيع من إطلاقها في مستودعات بلازميد، مثل أدجين.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم هذا العمل من خلال منحة كاتب ERC (282047)، وجائزة ويلكوم للمحققين الاستئمانيين (095589/Z/11/Z)، ومنحة FP7 EC DESIRE، وجائزة معهد ليستر إلى JB. ويدعم العمل في مختبر V.P. من قبل BBSRC (BB/L022974/1)، ومجلس البحوث الطبية في المملكة المتحدة (MRC)، ومعهد فرانسيس كريك (الذي يتلقى التمويل من MRC، أبحاث السرطان في المملكة المتحدة، وصندوق ويلكوم الاستئماني). وقد أمكن إجراء البحوث في مختبر M.D. من خلال منحة من مؤسسة ستافروس نيارخوس إلى B.S.R.C. “Alexander Fleming”، كجزء من مبادرة المؤسسة لدعم البحوث اليونانية.
Materials
| Medium/Supplements | |||
| B-27 | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 175040-044 | |
| DMEM/F12 | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 21331-020 | |
| DNAse | SIGMA | DN15-100MG | |
| FBS | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 10270-098 | |
| 100x Glutamine | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 35050-061 | |
| L15 | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 11415-049 | |
| MEM alpha, GlutaMAX | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 32561-029 | |
| Neurobasal medium | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 21103-049 | Neuron basic medium |
| 100x P/S | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 15140-122 | |
| Equipment | |||
| Electroporator | BTX | ECM 830 generator | |
| Injector for acute slice electroporation | Eppendorf | FemtoJet Microinjector | |
| Injector for cell transplantation (I) | Visual Sonics | Vevo Injector System | |
| Injector for cell transplantation (II) | WPI | NANOLITER2010 | |
| Magnetic Stand | WPI | M10L Magnetic Stand | |
| Kite Manual Micromanipulator | WPI | KITE-M3-R | |
| Platinum Elecrode (I) | Protech International Inc. | CUY-700-1 | |
| Platinum Elecrode (II) | Protech International Inc. | CUY-700-2 | |
| Steel Base Plate | WPI | 5479 | |
| Vibratome | Leica | VT1200S | |
| Other Material | |||
| Glass capillaries for electroporation | VWR | 1B100-4 | |
| Glass capillaries for cell transplantation | Visual Sonics | provided by Visual Sonics | |
| Nuclepore 8 µm whatman membrane | SLS | 110414 | |
| Organ tissue culture dishes | BD Biosciences (Falcon) | 353037 |
References
- Marin, O. Interneuron dysfunction in psychiatric disorders. Nature Review Neuroscience. 13 (2), 107-120 (2012).
- Glausier, J. R., Lewis, D. A. GABA and schizophrenia: Where we stand and where we need to go. Schizophrenia Research. 181, 2-3 (2017).
- Fishell, G., Rudy, B. Mechanisms of inhibition within the telencephalon: “where the wild things are”. Annual Review Neuroscience. 34, 535-567 (2011).
- Wamsley, B., Fishell, G. Genetic and activity-dependent mechanisms underlying interneuron diversity. Nature Review Neuroscience. 18 (5), 299-309 (2017).
- Xu, Q., Cobos, I., De La Cruz, E., Rubenstein, J. L., Anderson, S. A. Origins of cortical interneuron subtypes. Journal of Neuroscience. 24 (11), 2612-2622 (2004).
- Denaxa, M., et al. Maturation-promoting activity of SATB1 in MGE-derived cortical interneurons. Cell Reports. 2 (5), 1351-1362 (2012).
- Wichterle, H., Garcia-Verdugo, J. M., Herrera, D. G., Alvarez-Buylla, A. Young neurons from medial ganglionic eminence disperse in adult and embryonic brain. Nature Neuroscience. 2 (5), 461-466 (1999).
- Alvarez-Dolado, M., et al. Cortical inhibition modified by embryonic neural precursors grafted into the postnatal brain. Journal of Neuroscience. 26 (28), 7380-7389 (2006).
- Baraban, S. C., et al. Reduction of seizures by transplantation of cortical GABAergic interneuron precursors into Kv1.1 mutant mice. Proccedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (36), 15472-15477 (2009).
- Southwell, D. G., et al. Interneurons from embryonic development to cell-based therapy. Science. 344 (6180), 1240622 (2014).
- Vogt, D., et al. Viral-mediated Labeling and Transplantation of Medial Ganglionic Eminence (MGE) Cells for In Vivo Studies. Journal of Visualized Experiments. (98), e52740 (2015).
- De Marco Garcia, N. V., Karayannis, T., Fishell, G. Neuronal activity is required for the development of specific cortical interneuron subtypes. Nature. 472 (7343), 351-355 (2011).
- Urban, D. J., Roth, B. L. DREADDs (designer receptors exclusively activated by designer drugs): chemogenetic tools with therapeutic utility. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 55, 399-417 (2015).
- Denaxa, M., et al. Modulation of Apoptosis Controls Inhibitory Interneuron Number in the Cortex. Cell Reports. 22 (7), 1710-1721 (2018).
- Quatrocolo, G., et al. Homochronic Transplatation of Interneuron Precursors into Early Postnatal Mouse Brains. Journal of Visualized Experiments. (136), e57723 (2018).
- Southwell, D. G., et al. Intrinsically determined cell death of developning cortical interneurons. Nature. 491 (7422), 103-113 (2012).
