Trapianto di progenitori interneuroni corticali chemiogeneticamente ingegnerizzati nei primi cervelli dei topi postnatali

Gli animali sono stati allevati e alloggiati in conformità con il United Kingdom Animals (Scientific Procedures) Act (1986). NOT:</ Per la generazione del costrutto pCAGGs-hM3D(Gq)-IRES-RFP, un frammento SalI-StuI, contenente la sequenza hM3D(Gq), è stato isolato dal plasmide 50463 (Addgene) e inserito nel vettore di espressione pCAGGs-RFP (regalo da F. Guillemot) condigere con digerito con digestione con glasmida 50463 (Addgene) e inserito nel vettore di espressione pCAGGs-RFP (regalo da F. Guillemot) digerito con digestione con XhoI-EcoRV. 1. Preparazione di fette corticali embrionali embrionali di topo Sterilizzare le apparecchiature di laboratorio (ad esempio, microscopi stereo) e le superfici (ad esempio, le panchine) con un solvente detergente appropriato e una soluzione di etanolo (EtOH) del 70% in acqua (H2O). Utilizzare strumenti di dissezione che sono stati autoclaved e tenerli per tutto il tempo in 100% EtOH. Preparare tre 20 mL di agaa a bassa temperatura del 4% in una soluzione cuscinetto da 1x fosfato (PBS), in tubi da 50 mL, e tenerli a 55 gradi centigradi. Sacrificare i topi in stato di gravidanza per lussazione cervicale a 13,5 o 14,5 giorni di gestazione (giorno embrionale E13.5-E14.5). Con un paio di forbici dissezione, aprire l’addome dei topi in gravidanza, rimuovere le corna uterine (con gli embrioni) e metterle in soluzione Krebs ghiacciata (Tabella 1), in un piatto Petri da 90 mm. Con un paio di pinze sottili per studenti dritti, aprire le sacche amniotiche, rimuovere gli embrioni e trasferirli in una soluzione Krebs fresca ghiacciata, in una nuova parabola Petri da 90 mm. Dissezionare il cervello dell’embrione di topo (prosencefalo, midbrain, cervello posteriore) dal resto del corpo dell’embrione. Tenendo i cervelli sezionati dal cervello posteriore, trasferirli in soluzione Krebs ghiacciata in una nuova parabola Petri da 90 mm e tenerli sul ghiaccio. Con una penna impermeabile, disegnare una linea retta sulla superficie esterna, nel mezzo della parte inferiore di sei piatti Petri da 35 mm. Mettere un 4% agarose a bassa gelatura/PBS 20 mL a 37 gradi per 5 min. NOT:</ I bulbi olfattivi devono essere rivolti verso il basso (fondo del piatto Petri). Incorporare 3-4 cervelli per piatto Petri, allinearli nella linea retta precedentemente disegnata. Lasciare uno spazio di 3 x 5 mm tra ogni due cervelli. Ripetere i passaggi 1.8 e 1.9 fino a quando tutti i cervelli sezionati sono stati incorporati. Posizionare i cervelli incorporati a 4 gradi centigradi, in modo che l’agarosa si solidifichi, e successivamente intagliare i tre cervelli in un unico blocco di dimensioni e orientamento appropriati. NOT:</ Lasciare circa 3 mm intorno ai bordi dei campioni cerebrali. Cambiare l’orientamento del cervello, con i bulbi olfattivi sulla parte superiore. Incollare il blocco sulla superficie di una base di microtomi e utilizzando una lama chirurgica tagliata fino al fondo del blocco, tra ogni due cervelli, al fine di creare 3 blocchi indipendenti (ogni mini blocco contenente un cervello). Sezionare i blocchi, in soluzione Krebs ghiacciata, in fette spesse 250 m, utilizzando un microtoma a lama vibrante. Con una micro-spatola piatta piegata raccogli solo le fette contenenti le eminenze ganglioiane mediali o caudali (MGE o CGE; Figura 1) e trasferirli individualmente sulle membrane filtranti (13 m di diametro, 8,0 m di dimensione dei pori), galleggiando su un mezzo essenziale minimo (MEM, Tabella1) in piatti di coltura organo di qualità in polistirolo (60 mm x 15 mm). Mettere i piatti in un’incubatrice a coltura di tessutoco2, a 37 gradi centigradi, per 1 h, e prepararsi per l’elettroporazione focale. 2. Elettroporazione acuta del cervello Prima di iniziare la procedura di elettroporazione, preparare 50 mL di 1% gel di agarose in una piastra Petri 100 mm. Lasciare che il gel di agarose si solidifici a temperatura ambiente (RT) per circa 30 min. Preparare piccole colonne di agarose (1 mm di diametro e 10 mm di lunghezza), perforate con una pipetta di vetro (lunghezza 225 mm; 2 mL di capacità) e trasferirle in soluzioni Krebs ghiacciate. NOT:</ Una lampadina contagocce di gomma adatta a 2 mL pipette è attaccata alla pipetta, e premendola la colonna può essere rilasciata dalla pipetta di vetro alla soluzione Krebs. Con una lama chirurgica, tagliare piccoli blocchi di agarose di due dimensioni: uno piccolo che si adatta sulla superficie dell’elettrodo (vedi sotto) e uno più grande, che verrà utilizzato come base per eseguire le iniezioni di DNA focale nelle fette cerebrali. Trasferire i blocchi di agarose in soluzione Krebs ghiacciata. Preparare l’impostazione per le iniezioni focali e l’elettroporazione acuta (Figura 2). NOT:</ Per le iniezioni, è necessaria la seguente attrezzatura: 1) una dissezione del campo luminoso stereo-microscopio, 2) un iniettore pico-pompa pneumatico, 3) un micromanipolatore, 4) un supporto magnetico, e 5) una piastra di base in acciaio. Per l’elettroporazione acuta a fette, è necessaria la seguente attrezzatura: 1) un elettrodo piatto piatto Petri platino quadrato da 10 mm, 2) un elettrodo di copertura 10 mm platino quadrato, 3) un micromanipolatore e 4) un elettroporatore. Iniezioni di DNA focali Preparare una miscela di DNA di vettori di espressione: pCAGGs-IRES-GFP (vettore di controllo) – pCAGGs-hM3D(Gq)-IRES-RFP, con una concentrazione di 1 g/l per ogni vettore e aggiungere una soluzione verde veloce (stock 25 mg/mL) in una diluizione di 1/10. Riempire una micropipetta di vetro tirato (0,5 mm di diametro interno e 1 mm di diametro esterno) con 10 L della miscela di DNA e iniettare piccole quantità (sulla gamma 25-50 nL) nella regione selezionata (MGE/CGE) della fetta (Figura 1 e Figura 2). Elettroporazione acuta NOT:</ L’elettroporazione deve essere eseguita immediatamente dopo l’iniezione focale del DNA. Posizionare il piccolo blocco di agarose sull’elettrodo della piastra Petri e attaccare la colonna di agarose all’elettrodo di copertura mobile con l’aiuto di una micro-spatola piatta. Trasferire la fetta con la sua membrana di supporto sul blocco di agarose e posizionare l’elettrodo superiore con la colonna di agarose sulla parte superiore della regione selezionata (MGE/CGE) della fetta.NOTA: le tensioni di ricarica di 125 V (due impulsi di 5 ms ciascuno, l’intervallo 500 ms) produrranno un’elettroporazione riuscita (Figura 3). Dopo l’elettroporazione, mettere la fetta con la sua membrana di sostegno nel piatto e trasferire il piatto in un’incubatrice di coltura di tessuto CO 2, a 37 gradi centigradi. Dopo 1 h, scambiare il mezzo MEM per un mezzo di base appropriato per le colture neuronali primarie (mezzo di base del neurone; Tabella 1) e incubare le fette durante la notte, per circa 18-24 h. 3. Preparazione di innesti cellulari Controllare l’efficienza dell’elettroporazione in tutte le sezioni. Selezionare solo le sezioni in cui viene osservato un numero accettabile di celle fluorescenti (Figura 3). NOT:</ Elettroporate circa 30 fette / per esperimento al fine di acquisire il numero appropriato di cellule per l’innesto (vedi sotto). Dissezionare la regione selezionata (MGE/CGE) da ogni fetta e tagliare il tessuto in piccoli pezzi in soluzione Krebs ghiacciata, sotto una dissezione fluorescente stereo-microscopio. Nel frattempo, mettere un tubo da 1,5 mL con un mezzo di base di 900 – neurone in un bagno d’acqua a 37 gradi centigradi. Trasferire i pezzi di tessuto con un micropipettore P1000 su un tubo da 1,5 mL contenente 500 L di l15/DNase medio preparato aggiungendo 100 L di 1 mg/mL DNase stock in DMEM/F12 medio in 900 – L di L15 medio. Lavare i pezzi di tessuto toccando. Aggiungere 100 L di DNase (stock 1 mg/mL nel mezzo DMEM/F12) nel mezzo di base del neurone 900.L. Scartare il mezzo L15/DNase e risospendere i pezzi di tessuto in 200 – lneurone di base/Media DNase preparato nel passaggio 3.5. Impostare un micropipettor P200 a 180 – L e dissociare meccanicamente i pezzi di tessuto pipetting su e giù delicatamente, 20-30 volte, fino a ottenere una sospensione liscia e “cremosa”. Aggiungere 200 l di neurone basic/DNase medium (volume totale finale 400 ) e risospendere. Prendere un’aliquota di 4 celle, diluire in modo appropriato e montare su un emocitometro. Sotto un microscopio a campo luminoso, controllare l’efficienza della dissociazione e contare il numero di cellule. NOT:</ Se la dissociazione ha successo, verranno osservate singole cellule luminose (vive) e non aggregazioni cellulari. Sospensione cellulare centrifuga dal passo 3.8, a 1.000 rpm, a RT, per 5 min, e successivamente, rimuovere il supernatante dal tubo e aggiungere il mezzo L15/DNase appropriato (di solito 5-7 L) in modo che la concentrazione finale delle cellule sarà 8 x 105-1,2 x 106 cellule/L. NOT:</ Durante la sospensione, è estremamente importante evitare le bolle d’aria. Posizionare l’aliquota della cella sul ghiaccio e avere un ulteriore supporto L15/DNase per le iniezioni. 4. Iniezioni intracraniche NOT:</ Le seguenti procedure si svolgono in una sala procedure all’interno dello Animal House Facility. Poiché le cellule saranno iniettate direttamente al cervello dei cuccioli appena nati senza esporre il cervello, le condizioni asettiche vengono mantenute sterilizzando lo spazio di lavoro con la soluzione 70% EtOH e utilizzando aghi di vetro autoclati. Per le iniezioni intracraniche sono necessarie le seguenti apparecchiature: 1) uno stereoscopio di dissezione del campo luminoso, 2) un microiniettore e 3) un pad di riscaldamento per il recupero del mouse. Preparare un ago di vetro tirando gli aghi secondo le raccomandazioni del produttore. In questo protocollo vengono utilizzati aghi di vetro con un diametro esterno di 80 m, un diametro interno di 40 m e una smussatura di 30 metri. NOT:</ Come accennato in precedenza, gli aghi devono essere autoclavi prima dell’uso. Riempire manualmente l’ago con olio biologicamente inerte utilizzando un ago da 30 G, 2 pollici e una siringa. Assemblare e inserire l’ago nell’iniettore secondo le istruzioni del produttore. Determinare le impostazioni di iniezione al volume massimo (69 nL) e una velocità lenta relativa (23 nL/s). Svuotare l’ago fino a quando lo stantuffo è completamente esteso. Riempire l’ago. Tagliare un piccolo pezzo da un nastro di innesto e posizionarlo sotto un campo luminoso dissezione stereo-microscopio. Con una micropipetta P10, trasferire 5 OL dal campione (aliquota cellulare) sul nastro, in modo da formare una goccia sferica. Posizionare la punta dell’ago nel campione e riempire l’ago (lo stantuffo si ritrae e disegna il campione con esso). NOT:</ Poiché il campione dovrebbe essere abbastanza viscoso, riempire l’ago a piccoli passi in modo che il campione venga equilibrato e a una velocità lenta che impedisce la formazione di bolle. Il campione deve essere liscio e omogeneo all’interno dell’ago. Se il campione è troppo viscoso e non è possibile riempire l’ago, aggiungere tanto supporto L15/DNase quanto è necessario per ottenere la viscosità corretta. Tuttavia, questo cambierà la concentrazione del campione, e idealmente dovrebbe essere evitato. Anasthetize nuovi cuccioli (giorno postnatale 0-2 [P0-P2]) sul ghiaccio per 2-5 min. NOT:</ Assicurarsi che il cucciolo non si muova. Posizionare il cucciolo aestizzato sotto il campo luminoso dissezione stereo-microscopio. Eseguire 3-4 iniezioni di 69 nL ciascuna in ogni emisfero. NOT:</ I siti di iniezione si trovano circa 1 mm laterale alla linea mediana, e tra 1 mm caudal a bregma e 1 mm rostral alla linea interaurale. La punta dell’ago deve essere posizionata a circa 1 mm di profondità sulla superficie del pial. Dopo ogni iniezione, l’ago viene lasciato in posizione per circa 30 s e ritirato in periodi. Subito dopo le iniezioni, posizionare il cucciolo su una piastra di riscaldamento con il riscaldamento al suo minimo impostazione (37 gradi centigradi). Quando il cucciolo recupera trasferirlo alla gabbia con la madre. NOT:</ Non lasciare mai la madre senza cuccioli nella gabbia. L’intera procedura (dalla rimozione del cucciolo dai suoi compagni di cuccioli, fino al suo ritorno) dovrebbe durare meno di 10 min. 5. Iniezioni di clozapina-n-ossido Preparare la soluzione di ligando DREADD, CNO diluindo 1 mg di CNO in 50 – L di solforosa dimetilo (DMSO) fino a quando la soluzione è traslucida. Top-up a 10 mL con salina in modo che la concentrazione finale di CNO è 0.1 mg/mL. NOT:</ Il DMSO è tossico. Evitare di utilizzarlo per una concentrazione superiore allo 0,1%. Utilizzare come controllo una soluzione salina contenente la stessa concentrazione DMSO della soluzione contenitore CNO. Dal giorno postnatale 14 e per 3 giorni di stitiro (P14-P16), in ogni topo eseguire due iniezioni intraperitoneali (I.P.) di CNO (concentrazione CNO: 1 mg/kg) o 0,05% DMSO in salina, al giorno, a distanza di 12 h. L’ultimo giorno (P17), eseguire una singola iniezione e sacrificare i topi per lussazione cervicale in un intervallo di tempo di 30 min-1 h.