Trasplante de progenitores interneuronas corticales de ingeniería química en cerebros de ratón postnatal temprano

Los animales fueron criados y alojados de conformidad con la Ley de Animales (Procedimientos Científicos) del Reino Unido (1986). NOTA: Para la generación de la construcción pCAGGs-hM3D(Gq)-IRES-RFP, un fragmento SalI-StuI, que contiene la secuencia hM3D(Gq), se ha aislado del plásmido 50463 (Addgene), y se ha insertado en el vector de expresión pCAGGs-RFP (regalo de F. Guilmot) digerido con digestión con XhoI-EcoRV. 1. Preparación de rodajas corticales de embriones de ratón Esterilizar equipos de laboratorio (por ejemplo, microscopios estéreo) y superficies (por ejemplo, bancos) con un disolvente detergente adecuado y una solución de etanol al 70% (EtOH) en agua (H2O). Utilice herramientas de disección que hayan sido autoclavedas y manténgalas todo el tiempo en 100% EtOH. Preparar tres alícuotas de 20 ml de agarosa de temperatura baja en 1x a 5o C en 1x solución tampón de fosfato (PBS), en tubos de 50 ml, y mantenerlas a 55 oC. Sacrificar ratones embarazadas por luxación cervical a los 13,5 o 14,5 días de gestación (día embrionario E13.5-E14.5). Con un par de tijeras de disección, abra el abdomen de los ratones embarazadas, retire los cuernos uterinos(con los embriones) y colóquelos en una solución de Krebs helada (Tabla 1), en un plato Petri de 90 mm. Con un par de fórceps finos para estudiantes rectos, abra los sacos amnióticos, retire los embriones y transfieralos en una solución fresca de Krebs heladas, en un nuevo plato Petri de 90 mm. Diseccionar el cerebro del embrión de ratón (forebrain, midbrain, hindbrain) del resto del cuerpo embrionario. Sosteniendo los cerebros diseccionados del cerebro trasero, transfiéralos en una solución Krebs helada en un nuevo plato Petri de 90 mm y guárdalos en hielo. Con una pluma impermeable, dibuje una línea recta en la superficie exterior, en el centro de la parte inferior de seis platos Petri de 35 mm. Colocar un 4% de agarosa baja en gel/PBS 20 ml a 37 oC durante 5 min. Inmediatamente después de unos 10 ml pobres en dos platos Petri de 35 mm e incrustar los cerebros diseccionados.NOTA: Las bombillas olfativas deben mirar hacia abajo (parte inferior de la placa Petri). Incruste 3-4 cerebros por plato Petri, alinee en la línea recta previamente dibujada. Deje espacio de 3 a 5 mm entre cada dos cerebros. Repita los pasos 1.8 y 1.9 hasta que todos los cerebros diseccionados estén incrustados. Colocar los cerebros incrustados a 4 oC, para que la agarosa se solidifique, y posteriormente tallar los tres cerebros en un solo bloque de tamaño y orientación apropiados.NOTA: Deje aproximadamente 3 mm alrededor de los bordes de las muestras cerebrales. Cambiar la orientación de los cerebros, con las bombillas olfativas en la parte superior. Pega el bloque en la superficie de una base de microtome y usando una cuchilla quirúrgica cortada hasta la parte inferior del bloque, entre cada dos cerebros, con el fin de crear 3 bloques independientes (cada mini bloque que contiene un cerebro). Secciona los bloques, en solución de Krebs helada, en rodajas de 250 m de espesor, usando un microtome de cuchilla vibratoria. Con una microespátula de extremo plano doblada recoger sólo las rodajas que contienen las eminencias gangliónicas mediales o caudales (MGE o CGE; Figura 1) y transferirlas individualmente a membranas filtrantes (13 m de diámetro, 8,0 m de tamaño de poro), flotando en un medio esencial mínimo (MEM, Tabla 1) en platos de cultivo de órganos de poliestireno centro-pozo (60 mm x 15 mm). Colocar los platos en una incubadora de cultivo de tejido CO 2, a 37oC, durante 1 h, y prepararse para la electroporación focal. 2. Electroporación de corte cerebral agudo Antes de comenzar el procedimiento de electroporación, prepare 50 ml de gel de agarosa al 1% en una placa Petri de 100 mm. Deje que el gel de agarosa se solidifique a temperatura ambiente (RT) durante aproximadamente 30 minutos. Prepare pequeñas columnas de agarosa (1 mm de diámetro y 10 mm de longitud), perforadas con una pipeta de vidrio (225 mm de longitud; capacidad de 2 ml) y transfieralas en soluciones Krebs heladas.NOTA: Una bombilla cuentagotas de goma adecuada para pipetas de 2 ml se une a la pipeta, y al presionarla la columna se puede liberar de la pipeta de vidrio a la solución Krebs. Con una cuchilla quirúrgica, cortar pequeños bloques de agarosa de dos tamaños: uno pequeño que cabe en la superficie del electrodo (ver más abajo) y uno más grande, que se utilizará como base para realizar las inyecciones focales de ADN en las rodajas de cerebro. Transfiera también los bloques de agarosa en una solución de Krebs helada. Preparar la configuración para las inyecciones focales y la electroporación aguda (Figura 2).NOTA: Para las inyecciones, se necesita el siguiente equipo: 1) un microscopio estéreo de disección de campo brillante, 2) un inyector neumático pico-bomba, 3) un micromanipulador, 4) un soporte magnético y 5) una placa base de acero. Para la electroporación aguda de la rebanada, se necesita el siguiente equipo: 1) un electrodo de plato Petri de platino cuadrado de 10 mm, 2) un electrodo de cubierta de platino cuadrado de 10 mm, 3) un micromanipulador y 4) un electroporator. Inyecciones focales de ADN Preparar una mezcla de ADN de vectores de expresión: pCAGGs-IRES-GFP (vector de control) + pCAGGs-hM3D(Gq)-IRES-RFP, a una concentración de 1 g/l para cada vector y añadir una solución verde rápida (stock 25 mg/mL) en una dilución de 1/10. Llenar una micropipeta de vidrio tirado (0,5 mm de diámetro interior y 1 mm de diámetro exterior) con 10 ml de la mezcla de ADN e inyectar pequeñas cantidades (en el rango de 25-50 nL) en la región seleccionada (MGE/CGE) de la rebanada (Figura1 y Figura 2). Electroporación agudaNOTA: La electroporación debe realizarse inmediatamente después de la inyección focal de ADN. Coloque el pequeño bloque de agarosa en el electrodo de la placa Petri y adjunte la columna de agarosa al electrodo de cubierta móvil con la ayuda de una microespátula plana. Transfiera la rebanada con su membrana de soporte al bloque de agarosa y coloque el electrodo superior con la columna de agarosa en la parte superior de la región seleccionada (MGE/CGE) de la rebanada.NOTA: Los voltajes de carga de 125 V (dos pulsos de 5 ms cada uno, intervalo 500 ms) producirán una electroporación exitosa (Figura3). Después de la electroporación, coloque la rebanada con su membrana de soporte en el plato y transfiera el plato en una incubadora de cultivo de tejido CO 2, a 37 oC. Después de 1 h, cambie el medio MEM por un medio básico apropiado para cultivos neuronales primarios (medio básico de neurona; Tabla 1) e incubar las rodajas durante la noche, durante aproximadamente 18-24 h. 3. Preparación de injertos celulares Compruebe la eficiencia de la electroporación en todas las rodajas. Seleccione solo los sectores en los que se observa un número aceptable de celdas fluorescentes (Figura 3).NOTA: Electroportar aproximadamente 30 rodajas/por experimento para adquirir el número adecuado de células para el injerto (ver más abajo). Diseccionar la región seleccionada (MGE/CGE) de cada rebanada y cortar el tejido en trozos pequeños en solución de Krebs helada, bajo un estereomicroscopio de disección fluorescente. Mientras tanto, coloque un tubo de 1,5 ml con un medio básico de neurona de 900 ml en un baño de agua a 37 oC. Transfiera las piezas de tejido con un micropipetador P1000 a un tubo de 1,5 ml que contenga 500 ml de medio L15/DNase preparado añadiendo 100 ml de 1 mg/ml de dnase en medio DMEM/F12 a 900 ml de medio L15. Lave las piezas de tejido tocando. Añadir 100 l de DNase (stock 1 mg/ml en medio DMEM/F12) en el medio básico de la neurona de 900 l. Deseche el medio L15/DNase y resuspenda las piezas de tejido en un medio básico/DNase de neurona de 200 l preparado en el paso 3.5. Ajuste un micropipetador P200 a 180 l y disocia mecánicamente las piezas de tejido pipeteando hacia arriba y hacia abajo suavemente, 20-30 veces, hasta obtener una suspensión suave y “cremosa”. Añadir 200 l de medio básico/DNase de la neurona (volumen total final 400 l) y resuspender. Tomar una alícuota de 4 l de células, diluir adecuadamente y montar en un hemocitómetro. Bajo un microscopio de campo brillante, compruebe la eficiencia de la disociación y cuente el número de células.NOTA: Si la disociación es exitosa, se observarán células individuales brillantes (vivas) y no agregados de células. Suspensión de celda de centrífuga del paso 3.8, a 1.000 rpm, a RT, durante 5 min, y posteriormente, retire el sobrenadante del tubo y agregue el medio L15/DNase apropiado (generalmente 5-7 l) para que la concentración final de las células sea de 8 x 105-1.2 x 106 células/L.NOTA: Durante la resuspensión, es extremadamente importante evitar las burbujas de aire. Coloque la alícuota celular sobre hielo y tenga un medio adicional De15/DNase para las inyecciones. 4. Inyecciones intracraneales NOTA: Los siguientes procedimientos tienen lugar en una sala de procedimientos dentro de la Instalación de la Casa de Animales. Dado que las células se inyectarán directamente en el cerebro de los cachorros recién nacidos sin exponer el cerebro, las condiciones asépticas se mantienen esterilizando el espacio de trabajo con 70% de solución EtOH y utilizando agujas de vidrio autoclave. Se necesita el siguiente equipo para las inyecciones intracraneales: 1) un estereomicroscopio de disección de campo brillante, 2) un microinyector y 3) una almohadilla de calentamiento para la recuperación del ratón. Prepare una aguja de vidrio tirando de agujas de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. En este protocolo se utilizan agujas de vidrio con un diámetro exterior de 80 m, un diámetro interior de 40 m y un bisel de 30o.NOTA: Como se mencionó anteriormente, las agujas deben ser autoclavedas antes de su uso. Rellene manualmente la aguja con aceite biológicamente inerte utilizando una aguja de 30 G, 2 pulgadas y una jeringa. Montar e insertar la aguja en la unidad inyector de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Determine los ajustes de inyección al volumen máximo (69 nL) y a una velocidad relativa lenta (23 nL/s). Vacíe la aguja hasta que el émbolo esté completamente extendido. Llene la aguja. Corta una pequeña pieza de una cinta de injerto y colóquela bajo un microscopio estéreo de disección de campo brillante. Con un micropipeta P10, transfiera 5 l de la muestra (alícuota celular) a la cinta, de modo que se forme una gota esférica. Coloque la punta de la aguja en la muestra y llene la aguja (el émbolo se retrae y dibuja la muestra con ella).NOTA: Dado que la muestra debe ser bastante viscosa, llene la aguja en pequeños pasos para que la muestra se equilibre, y a una velocidad lenta que impida la formación de burbujas. La muestra debe ser lisa y homogénea dentro de la aguja. Si la muestra es demasiado viscosa y no es posible llenar la aguja, añada tanto medio L15/DNase como sea necesario para obtener la viscosidad correcta. Sin embargo, esto cambiará la concentración de la muestra, e idealmente debe evitarse. Anestesiar cachorros recién nacidos (día postnatal 0-2 [P0-P2]) sobre hielo durante 2-5 min.NOTA: Asegúrese de que el cachorro no se está moviendo. Coloque el cachorro anestesiado bajo el microscopio estéreo de disección de campo brillante. Realizar 3-4 inyecciones de 69 nL cada una en cada hemisferio.NOTA: Los sitios de inyección se encuentran aproximadamente 1 mm lateral a la línea media, y entre 1 mm caudal a bregma y 1 mm rostral a la línea interaural. La punta de la aguja debe colocarse aproximadamente 1 mm de profundidad en la superficie pial. Después de cada inyección, la aguja se deja en su lugar durante aproximadamente 30 s y se retira en períodos. Inmediatamente después de las inyecciones, coloque el cachorro en una almohadilla de calentamiento con la calefacción en su ajuste más bajo (37 oC). Cuando el cachorro se recupera transferirlo a la jaula con su madre.NOTA: Nunca dejes a la madre sin cachorros en la jaula. Todo el procedimiento (de retirar el cachorro de sus camadas, hasta que se devuelve) debe durar menos de 10 minutos. 5. Inyecciones de clozapina-N-óxido Preparar el ligando DREADD, solución de cNO mediante la dilución de 1 mg de CNO en 50 l de dimetil sulfóxido (DMSO) hasta que la solución sea translúcida. Recarga hasta 10 ml con salina para que la concentración final de CNO sea de 0,1 mg/ml.NOTA: DMSO es tóxico. Evitar usarlo a una concentración superior a 0,1%. Utilizar como control una solución salina que contenga la misma concentración de DMSO que la solución que contiene CNO. A partir del día postnatal 14 y durante 3 días constitutivamente (P14-P16), en cada ratón realizar dos inyecciones intraperitoneales (I.P.) de CNO (concentración CNO: 1 mg/kg) o 0,05% DMSO en solución salina, por día, 12 h de separación. En el último día (P17), realizar una sola inyección y sacrificar ratones por luxación cervical dentro de una ventana de tiempo de 30 min-1 h.