Erken Doğum Sonrası Fare Beyinlerine Kemogenetik Mühendislik Kortikal İnkornöron Progenitorlarının Nakli

Hayvanlar, Birleşik Krallık Hayvanlar (Bilimsel Prosedürler) Yasası (1986) uyarınca yetiştirildi ve barındırıldı. NOT: pCAGGs-hM3D(Gq)-IRES-RFP yapısının üretimi için, hM3D(Gq) dizisini içeren bir SalI-StuI parçası plazmid 50463 ‘den izole edilmiş ve ifade vektörpCAGGs-RFP (F. Guille’den hediye) ile sindirilmiş olarak eklenmiştir. XhoI-EcoRV. 1. Fare Embriyosu Kortikal Dilimlerinin Hazırlanması Laboratuvar ekipmanlarını (örn. stereo mikroskoplar) ve yüzeyleri (örn. banklar) uygun bir deterjan çözücü ve suda etanol (EtOH) çözeltisi (H2O) ile sterilize edin. Otoklavlanmış diseksiyon araçlarını kullanın ve bunları her zaman 0 EtOH’ta saklayın. 50 mL tüplerde 1x fosfat tampon çözeltisinde (PBS) %4 düşük jellemalı agarose üç adet 20 mL aliquot hazırlayın ve 55 °C’de tutun. Gebe fareleri 13.5 veya 14.5 günlük gebelikte servikal çıkığı ile kurban edin (embriyonik gün E13.5-E14.5). Bir çift diseksiyon makası ile, hamile farelerin karnını açın, rahim boynuzlarını (embriyolarla birlikte) çıkarın ve 90 mm’lik Petri kabına buz gibi krebs çözeltisi (Tablo1)yerleştirin. Düz öğrenci ince forseps bir çift ile, amniyotik keseleri açın, embriyoları kaldırmak ve taze buz gibi Krebs çözeltisi onları transfer, yeni bir 90 mm Petri çanak. Fare embriyo beyin (ön beyin, orta beyin, arka beyin) embriyo vücudunun geri kalanından diseksiyon. Kesilen beyinleri arka beyinden tutarak, buz gibi Krebs çözeltisi içinde yeni bir 90 mm Petri kabına aktarın ve onları buzda tutun. Su geçirmez bir kalemle, altı adet 35 mm Petri kabının alt kısmının ortasına dış yüzeye düz bir çizgi çizin. 37 °C’de %4 düşük jelleştirici agarose/PBS 20 mL aliquot 5 dk. Hemen ardından iki 35 mm Petri kabına 10 mL’lik zayıflık yerleştirin ve parçalanmış beyinleri gömün.NOT: Koku ampulleri aşağı ya da petri kabının alt yüz gerekir. Petri kabına 3-4 beyin yerleştirin, daha önce çizilmiş düz çizgide hizalayın. Her iki beyin arasında 3−5 mm boşluk bırakın. Tüm parçalara ayrılan beyinler yerleştirilene kadar 1.8 ve 1.9 adımlarını tekrarlayın. Gömülü beyinleri 4 °C’ye yerleştirin, agarose’un katılaşması için, ve daha sonra üç beyni uygun boyut ve oryantasyonda tek bir blok halinde oyun.NOT: Beyin örneklerinin kenarlarında yaklaşık 3 mm bırakın. Üst kısmında koku ampulleri ile, beyin yönünü değiştirin. Bir mikrotom tabanının yüzeyinde tutkal blok ve bir cerrahi bıçak kullanarak bloğun alt boyunca tüm yol kesilmiş, her iki beyin arasında, amacıyla 3 bağımsız blok (her mini blok bir beyin içeren) oluşturmak için. Blokları buz gibi Krebs çözeltisinde, titreşen bir bıçak mikrotom’u kullanarak 250 μm kalınlığında dilimlere ayırın. Bükülmüş düz uçlu mikro-spatula ile sadece medial veya kaudal ganglionik itibarlar (MGE veya CGE içeren dilimleri toplamak; Şekil 1) ve polistiren merkezi-iyi organ kültür yemeklerinde (60 mm x 15 mm) minimum esansiyel ortamda (MEM, Tablo1) yüzen filtre membranlarına (13 m çapında, 8,0 m gözenek boyutu) ayrı ayrı aktarın. Bulaşıkları 37 °C’de bir CO2 doku kültürü kuluçka makinesine yerleştirin ve fokal elektroporasyona hazırlanın. 2. Akut Beyin Dilimi Elektroporasyon Elektroporasyon işlemine başlamadan önce, 100 mm Petri kabına %1 agarose jelin 50 mL’sini hazırlayın. Yaklaşık 30 dakika oda sıcaklığında (RT) katılaşmak için agarose jel bırakın. Küçük agarose kolonları (1 mm çap ve 10 mm uzunluk), cam pipet (225 mm uzunluk; 2 mL kapasiteli) ile delinmiş ve buz gibi Krebs çözeltilerinde aktarın.NOT: Pipete 2 mL pipete uygun bir kauçuk damlalık ampulü bağlanır ve kolonu basılarak cam pipetten Krebs çözeltisine kadar serbest bırakılabilir. Bir cerrahi bıçak ile, iki boyutta küçük agarose blokları kesti: elektrot yüzeyine uyacak küçük bir (aşağıya bakın) ve daha büyük bir, beyin dilimleri içine odak DNA enjeksiyonları gerçekleştirmek için bir üs olarak kullanılacak. Buz gibi Krebs çözeltisi içinde agarose blokları da aktarın. Odak enjeksiyonları ve akut elektroporasyon için kurulum hazırlayın (Şekil2).NOT: Enjeksiyonlar için aşağıdaki ekipmangereklidir: 1) parlak alan diseksiyonu stereo-mikroskop, 2) pnömatik piko-pompa enjektörü, 3) bir mikromanipülatör, 4) manyetik stand ve 5) çelik taban plakası. Akut dilim elektroporasyonu için aşağıdaki ekipmana ihtiyaç vardır: 1) bir kare platin 10 mm Petri kabı elektrodu, 2) bir kare platin 10 mm kapak elektrodu, 3) bir mikromanipülatör ve 4) bir elektroporatör. Odak DNA enjeksiyonları İfade vektörlerinin DNA karışımını hazırlayın: pCAGGs-IRES-GFP (kontrol vektörü) + pCAGGs-hM3D(Gq)-IRES-RFP, her vektör için 1 μg/μL konsantrasyonda ve 1/10 seyreltme de hızlı yeşil çözelti (stok 25 mg/mL) ekleyin. Çekilen cam mikropipetini (0,5 mm iç çapı ve 1 mm dış çapı) 10 μL DNA karışımıyla doldurun ve dilimin seçili bölgesine (MGE/CGE) küçük miktarlarda (25-50 nL aralığında) enjekte edin (Şekil1 ve Şekil2). Akut elektroporasyonNOT: Elektroporasyon fokal DNA enjeksiyonundan hemen sonra yapılmalıdır. Petri çanak elektrot üzerinde küçük agarose blok yerleştirin ve düz uçlu mikro-spatula yardımı ile mobil kapak elektrot agarose sütun takın. Destek membranı ile dilimi agarose bloğuna aktarın ve seçili bölgenin (MGE/CGE) üzerine agarose sütunlu üst elektrodu yerleştirin.NOT: 125 V’lik şarj gerilimleri (her biri 5 ms, aralık 500 ms) başarılı bir elektroporasyon sağlayacaktır (Şekil 3). Elektroporasyondan sonra, destek membranı ile dilimi tabağa yerleştirin ve 37 °C’de bir CO2 doku kültürü kuluçka makinesine aktarın. 1 saat sonra, birincil nöronal kültürler (nöron temel orta) için uygun temel bir orta MEM orta değişimi; Tablo 1) ve yaklaşık 18-24 saat boyunca, bir gecede dilimleri kuluçkaya yatırın. 3. Hücre greftlerinin hazırlanması Tüm dilimlerde elektroporasyon verimliliğini kontrol edin. Yalnızca kabul edilebilir sayıda floresan hücrenin gözlendiği dilimleriseçin (Şekil 3).NOT: Aşılama için uygun sayıda hücre elde etmek için deney başına yaklaşık 30 dilim/deney başına elektroporate (aşağıya bakın). Seçilen bölgeyi (MGE/CGE) her dilimden ayırın ve bir floresan diseksiyon stereo-mikroskop altında, buz gibi Krebs çözeltisi içinde küçük parçalar halinde doku kesti. Bu arada, 37 °C’deki bir su banyosuna 900 μL nöron temel orta ile 1,5 mL’lik bir tüp yerleştirin. P1000 mikropipetli doku parçalarını, DMEM/F12 ortam100 μL’lik 1 mg/mL DNase stoku eklenerek hazırlanan 500 μL L 15/DNase orta sını içeren 1,5 mL’lik bir tüpe aktarın. Dokunarak doku parçalarını yıkayın. 900 μL nöron temel ortamına 100 μL DNase (DMEM/F12 ortamda stok 1 mg/mL) ekleyin. L15/DNase ortamını atın ve adım 3.5’te hazırlanan 200 μL nöron temel/DNase ortasında doku parçalarını yeniden askıya alın. P200 mikropipettor’u 180 μL’ye ayarlayın ve pürüzsüz ve “kremsi” süspansiyon elde edilene kadar doku parçalarını hafifçe 20-30 kez yukarı ve aşağı borular atarak mekanik olarak ayrıştırın. 200 μL nöron temel/DNase orta (nihai toplam hacim 400 μL) ekleyin ve yeniden askıya alın. Hücrelerin 4 μL aliquot alın, uygun seyreltmek ve bir hemositometre üzerine monte. Parlak bir alan mikroskobu altında, dissosyasyon verimliliğini kontrol edin ve hücre sayısını saymak.NOT: Dissociation başarılı olursa, parlak (canlı) tek hücre ve hücre agregaları gözlenecektir. Merkezsel süspansiyon adım 3.8, at 1.000 rpm, RT, 5 dakika için, ve daha sonra, tüpten supernatant kaldırmak ve uygun L15/DNase orta ekleyin (genellikle 5-7 μL) böylece hücrelerin son konsantrasyonu 8 x 105-1.2 x 10 6 olacak hücreleri/μL’leri.NOT: Resuspension sırasında, hava kabarcıkları önlemek için son derece önemlidir. Hücre aliquot buz üzerine yerleştirin ve enjeksiyonlar için ek L15/DNase orta var. 4. İntrakraniyal Enjeksiyonlar NOT: Aşağıdaki işlemler Hayvan Evi Tesisi içinde bir prosedür odasında gerçekleşir. Hücreler doğrudan yenidoğan yavruların beyne beyin maruz kalmadan enjekte edilecek olduğundan, aseptik koşullar% 70 EtOH çözeltisi ile çalışma alanı sterilize ve otoklavcam iğneler kullanılarak tutulur. Aşağıdaki ekipman intrakranial enjeksiyonlar için gereklidir: 1) parlak bir alan diseksiyonu stereo-mikroskop, 2) bir mikro-enjektör, ve 3) fare kurtarma için bir ısıtma yastığı. Üreticinin tavsiyelerine göre iğne çekerek cam bir iğne hazırlayın. Bu protokolde 80 μm dış çapı, 40 μm iç çapı ve 30° yata sahip cam iğneler kullanılmaktadır.NOT: Yukarıda belirtildiği gibi, iğneler kullanmadan önce otoklavolmalıdır. 30 G, 2 inç iğne ve şırınga kullanarak iğneyi biyolojik olarak inert yağla manuel olarak doldurun. İğneyi üreticinin talimatlarına göre enjektör ünitesine monte edin ve takın. Enjeksiyon ayarlarını maksimum hacim (69 nL) ve göreceli yavaş hızı (23 nL/s) olarak belirleyin. Piston tamamen uzatılıncaya kadar iğneyi boşaltın. İğneyi doldur. Bir aşılama bandından küçük bir parça kesin ve parlak bir alan diseksiyon stereo-mikroskop altına yerleştirin. P10 mikropipeti ile, örnekten (hücre aliquot) 5 μL’yi banta aktarın, böylece küresel bir damla oluşur. İğneucunu numunenin içine yerleştirin ve iğneyi doldurun (piston geri çeker ve numuneyi onunla birlikte çeker).NOT: Örnek oldukça viskoz olması gerektiğinden, iğneyi küçük adımlarla doldurun, böylece örnek dengelenecek ve kabarcıkların oluşmasını engelleyen yavaş bir hızda. Örnek iğne içinde pürüzsüz ve homojen olmalıdır. Örnek çok viskoz ise ve iğneyi doldurmak mümkün değilse, doğru viskoziteyi elde etmek için gerekli olduğu kadar L15/DNase ortamı ekleyin. Yine de, bu örnek konsantrasyonu değişecektir, ve ideal kaçınılmalıdır. 2-5 dakika buz üzerinde yeni doğan yavrular (doğum sonrası gün 0-2 [P0-P2]) anestezi.NOT: Yavrunun hareket etmediä inden emin olun. Anestezili yavruyu parlak alan diseksiyonu stereo-mikroskobun altına yerleştirin. Her yarımkürede 69 nL’lik 3-4 enjeksiyon yapın.NOT: Enjeksiyon bölgeleri orta hatta yaklaşık 1 mm lateral, bregma için 1 mm kaudal ve interaural çizgiye 1 mm rostral arasında yer alır. İğneucu pial yüzeye yaklaşık 1 mm derinliğinde yerleştirilmelidir. Her enjeksiyondan sonra iğne yaklaşık 30 s’lik bir yerde bırakılır ve periyotlar halinde geri çekilir. Enjeksiyonlardan hemen sonra, yavruyu en düşük ayarında (37 °C) ısıtma yastığına yerleştirin. Yavru iyileştiğinde annesiyle birlikte kafese nakleder.NOT: Kafeste yavru olmadan anneyi asla bırakma. Tüm prosedür (yavrunun çöp arkadaşlarından çıkarılmasından, döndürülene kadar) 10 dakikadan az sürmelidir. 5. Klozapin-N-oksit Enjeksiyonları Çözelti yarı saydam olana kadar 50 μL dimetil sülfoksitte (DMSO) 1 mg CNO seyrelterek DREADD ligand, CNO stok çözeltisini hazırlayın. CNO’nun son konsantrasyonunun 0.1 mg/mL olması için tuzlu su ile 10 mL’ye kadar kontör.NOT: DMSO zehirlidir. %0,1’den daha yüksek bir konsantrasyonda kullanmaktan kaçının. CNO içeren çözelti ile aynı DMSO konsantrasyonuna neden olan tuzlu bir çözeltiyi kontrol etmek için kullanın. Doğum sonrası gün 14 ve 3 kontertikülel gün (P14-P16), her fare iki intraperitoneal (I.P.) CNO enjeksiyonları gerçekleştirmek (CNO konsantrasyonu: 1 mg / kg) veya 0.05% DMSO tuzlu, günde, 12 saat arayla. Son gün (P17), 30 dakika-1 saat bir zaman dilimi içinde servikal çıkış ile tek bir enjeksiyon ve kurban fareler gerçekleştirin.