Трансплантация хемогенетически инженерии Кортикальный интернерерон прародителей в начале послеродовой мозг мыши

В соответствии с Законом Соединенного Королевства о животных (научные процедуры) (1986 год) животные были выведены и размещены в соответствии с Законом Соединенного Королевства о животных (научные процедуры). ПРИМЕЧАНИЕ: Для генерации конструкции pCAGGs-hM3D (Gq)-IRES-RFP фрагмент SalI-StuI, содержащий последовательность hM3D (Gq), был выделен из плазмида 50463 (Addgene) и вставлен в вектор выражения pCAGGs-RFP (подарок от F. Guillemot) XhoI-EcoRV. 1. Подготовка мышь эмбриона кортикальные фрагменты Стерилизовать лабораторное оборудование (например, стерео микроскопы) и поверхности (например, скамейки) с соответствующим моющим средством и 70% раствора этанола (EtOH) в воде (H2O). Используйте инструменты вскрытия, которые были autoclaved и держать их все время в 100% EtOH. Приготовьте три аликоты по 20 мл с 4% низкой гелеобразующей температурой агарозы в 1x фосфатном буферном растворе (PBS), в трубках 50 мл, и держите их при температуре 55 градусов по Цельсию. Пожертвование беременных мышей путем вывиха шейки матки на 13,5 или 14,5 дней беременности (эмбриональный день E13.5-E14.5). С парой ножниц вскрытия, открыть живот беременных мышей, удалить рога матки (с эмбрионами) и поместить их в ледяной кребс решение (Таблица 1), в 90 мм Петри блюдо. С парой прямых студентов штрафа щипцы, открыть амниотические мешки, удалить эмбрионы и передать их в свежий ледяной Кребс раствор, в новом 90 мм Петри блюдо. Вскрыть мозг эмбриона мыши (предмозг, средний мозг, задний мозг) от остальной части тела эмбриона. Держа расчлененные мозги из заднего мозга, перенесите их в ледяной раствор Кребса в новой 90-мм чашке Петри, и держите их на льду. С водонепроницаемой ручкой нарисуйте прямую линию на внешней поверхности, в середине нижней части из шести 35 мм посуды Петри. Поместите один 4% низкогелящий агароз/PBS 20 мл аликот на 37 градусов по Цельсию в течение 5 мин. Сразу же после этого бедные 10 мл в двух 35 мм Петри блюда и вставлять расчлененные мозги.ПРИМЕЧАНИЕ: Обонятельные луковицы должны лицом вниз (внизу чашки Петри). Вставлять 3-4 мозга на чашку Петри, выравнивать их по ранее нарисованной прямой линии. Оставьте пространство размером 3,5 мм между каждыми двумя мозгами. Повторите шаги 1.8 и 1.9 до тех пор, пока все расчлененные мозги не будут встроены. Поместите встроенные мозги при 4 градусах Цельсия, чтобы агароза затвердела, а затем вырезать три мозга в один блок соответствующего размера и ориентации.ПРИМЕЧАНИЕ: Оставьте примерно 3 мм по краям образцов мозга. Измените ориентацию мозга, с обонятельными луковицами на верхней части. Клей блок на поверхности базы микротомов и с помощью хирургического лезвия вырезать весь путь через дно блока, между каждым и двумя мозгами, для того, чтобы создать 3 независимых блоков (каждый мини-блок, содержащий один мозг). Раздел и блоки, в ледяном растворе Кребса, на 250 мкм толщиной ломтиков, используя вибрирующий микротом лезвия. С изгибом плоский конец микро-шпатула собирать только ломтики, содержащие медиаль или каудальной ганглиятической выдавливания (MGE или CGE; Рисунок 1) и индивидуально переносите их на фильтровальные мембраны (диаметр 13 мкм, размер пор ы 8,0 мкм), плавающие на минимальной необходимой среде (MEM, Таблица 1) в полистирола центр-хорошо орган культуры блюда (60 мм х 15 мм). Поместите блюда в инкубатор культуры культуры CO 2, при 37 градусах По Цельсию, на 1 ч, и приготовьте для фокусного электропорирования. 2. Острый мозг фрагмент электропорации Перед началом процедуры электропорации приготовьте 50 мл 1% агарозного геля в 100 мм чашке Петри. Оставьте гель агарозы затвердеть при комнатной температуре (RT) в течение примерно 30 мин. Приготовьте крошечные агарозные колонны (1 мм в диаметре и 10 мм в длину), пронизывали стеклянным пипеткой (длина 225 мм; емкость 2 мл) и переносите их в ледяные решения Кребса.ПРИМЕЧАНИЕ: К пипетке крепится резиновая капельница, подходящая для 2 мл пипетки, и при нажатии на нее колонна может быть выпущена из стеклянной пипетки к раствору Кребса. С помощью хирургического лезвия вырежьте небольшие агарозные блоки двух размеров: небольшой, который будет укладываться на поверхности электрода (см. ниже) и более крупный, который будет использоваться в качестве основы для выполнения фокусных инъекций ДНК в ломтики мозга. Перенесите блоки агарозы в ледяной раствор Кребс, а также. Подготовьте настройку для фокусных инъекций и острой электропорации(рисунок2).ПРИМЕЧАНИЕ: Для инъекций необходимо следующее оборудование: 1) яркое поле рассечение стерео-микроскопа, 2) пневматический инжектор пико-насоса, 3) микроманипулятор, 4) магнитная подстилка, и 5) стальная базовая пластина. Для электропорации острого среза необходимо следующее оборудование: 1) 1 квадратная платина 10 мм петри блюдо электрод, 2) один квадратный платиновый 10 мм крышка электрода, 3) микроманипулятор, и 4) электропоратор. Фокусные инъекции ДНК Подготовьте ДНК-смесь векторов экспрессии: pCAGGs-IRES-GFP (контрольный вектор) – pCAGGs-hM3D (Gq)-IRES-RFP, в концентрации 1 мкг/л для каждого вектора и добавьте быстрый зеленый раствор (запас 25 мг/мл) в 1/10 разбавления. Заполните вытянутый стеклянный микропипет (0,5 мм внутреннего диаметра и 1 мм внешнего диаметра) с 10 зл и l смеси ДНК и вводить небольшие количества (на 25-50 nL диапазона) в выбранной области (MGE / CGE) ломтика(Рисунок 1 и Рисунок 2). Острая электропорацияПРИМЕЧАНИЕ: Электропорация должна быть выполнена сразу после фокусной инъекции ДНК. Поместите небольшой блок агарозы на электроде чашки Петри и прикрепите колонку агарозы к мобильному электроду крышки с помощью плоского микро-шпатулы. Перенесите срез с его поддерживающей мембраной на блок агарозы и поместите верхний электрод с столбцом агарозы поверх выбранной области (MGE/CGE) среза.ПРИМЕЧАНИЕ: Зарядка напряжения 125 V (два импульса по 5 мс каждый, интервал 500 мс) даст успешную электропорацию(рисунок 3). После электропорации поместите ломтик с его поддерживающей мембраной в блюдо и перенесите блюдо в инкубатор культуры культуры CO2 при 37 градусах Цельсия. После 1 ч, обмен MEM среды для базовой среды подходит для первичных нейронных культур (нейрон основной среде; Таблица 1) и инкубировать ломтики на ночь, примерно 18-24 ч. 3. Подготовка клеточных трансплантатов Проверьте эффективность электропорации во всех ломтиках. Выберите только ломтики, где наблюдается приемлемое количество флуоресцентных клеток(рисунок3).ПРИМЕЧАНИЕ: Электропорат примерно 30 ломтиков/за эксперимент для того, чтобы приобрести соответствующее количество клеток для прививки (см. ниже). Рассекать выбранную область (MGE/CGE) с каждого ломтика и разрезать ткань на мелкие кусочки в ледяном растворе Кребса, под флуоресцентным рассеиванием стерео-микроскопа. Между тем, поместите трубку 1,5 мл с 900 мл нейронов основной среде в водяной бане при 37 градусов по Цельсию. Перенесите кусочки ткани с микропипеттером P1000 в трубку 1,5 мл, содержащую 500 л средней l15/DNase, приготовленную путем добавления 100 кЛ 1 мг/мЛ DNase в DMEM/F12 среды в 900 л среды L15. Вымойте части ткани, нажав. Добавьте 100 кЛ DNase (запас 1 мг/мл в среде DMEM/F12) в базовую среду нейронов 900 л. Откажитесь от среды L15/DNase и переприостановите части ткани в 200 nn l basic/DNase среды, подготовленной в шаге 3.5. Установите микропипеттор P200 до 180 л и механически разъединяйте части ткани, плавно подняв и очем вниз, 20-30 раз, пока не будет получена гладкая и «сливочная» подвеска. Добавьте 200 зЛ нейронов базового/DNase среднего (окончательный общий объем 400 qL) и resuspend. Возьмите 4 qL аликот клеток, разбавить надлежащим образом и установить на гемоцитометр. Под ярким полевым микроскопом проверьте эффективность диссоциации и подсчитайте количество клеток.ПРИМЕЧАНИЕ: Если диссоциация успешна, будут наблюдаться яркие (живые) одиночные клетки, а не клеточные агрегаты. Суспензия центрифуг и свыше 3,8, при 1000 об/мин, на РТ, в течение 5 мин, а затем, удалить супернатант из трубки и добавить соответствующие L15/DNase среды (обычно 5-7 Л), так что окончательная концентрация клеток будет 8 х 105-1,2 х 106 клетки/Л.ПРИМЕЧАНИЕ: Во время повторной приостановки, это чрезвычайно важно, чтобы избежать пузырьков воздуха. Поместите аликот клетки на лед и дополнительные L15/DNase среды для инъекций. 4. Внутричерепные инъекции ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие процедуры проводятся в процедурном зале в комплексе Animal House. Так как клетки будут введены непосредственно в мозг новорожденных щенков, не подвергая мозга, асептические условия сохраняются путем стерилизации рабочего пространства с 70% EtOH раствор и с помощью автоклавированных стеклянных игл. Для внутричерепных инъекций требуется следующее оборудование: 1) яркое полерастительное рассечение стерео-микроскопа, 2) микро-инжектор и 3) грелка для восстановления мыши. Подготовка стеклянной иглы, потянув иглы в соответствии с рекомендациями производителя. Стеклянные иглы с 80 мкм внешнего диаметра, 40 мкм внутреннего диаметра, и 30 “скобы используются в этом протоколе.ПРИМЕЧАНИЕ: Как уже упоминалось выше, иглы должны быть autoclaved перед использованием. Заполните вручную иглу с биологически инертным маслом с помощью 30 G, 2-дюймовой иглы и шприца. Соберите и вставьте иглу в блок инжектора в соответствии с инструкциями производителя. Определите параметры впрыска при максимальном объеме (69 нл) и относительно медленной скорости (23 нл/с). Опустошите иглу до тех пор, пока поршень не будет полностью расширен. Заполните иглу. Вырежьте небольшой кусочек из прививной ленты и поместите ее под яркое поле вскрытия стерео-микроскопа. С помощью микропипетты P10 перенесите 5 qL из образца (клеточного аликота) на ленту, так что образуется сферическая капля. Поместите кончик иглы в образец и заполните иглу (плунжер втягивается и рисует образец с ним).ПРИМЕЧАНИЕ: Так как образец должен быть довольно вязким, заполните иглу небольшими шагами, чтобы образец уравновешизм, и с медленными темпами, что предотвращает образование пузырьков. Образец должен быть гладким и однородным внутри иглы. Если образец слишком вязкий и не представляется возможным заполнить иглу, добавьте столько L15/DNase среды, как это требуется для получения правильной вязкости. Тем не менее, это изменит концентрацию образца, и в идеале следует избегать. Анестезия новорожденных щенков (послеродовой день 0-2 «P0-P2») на льду в течение 2-5 мин.ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что щенка не движется. Поместите обезопподданного щенка под ярким полем вскрытия стерео-микроскопа. Выполните 3-4 инъекции по 69 нл каждый в каждом полушарии.ПРИМЕЧАНИЕ: Участки для инъекций расположены примерно на 1 мм боковой к средней линии, и между 1 мм каудал до брегмы и 1 мм ростральной к межрегиональной линии. Кончик иглы должен быть помещен примерно на 1 мм глубоко к поверхности пиала. После каждой инъекции, игла остается на месте в течение примерно 30 с и сняты в периоды. Сразу же после инъекций поместите щенка на грелку с нагревом в самом низком месте (37 градусов по Цельсию). Когда щенок восстанавливается передать его в клетку с матерью.ПРИМЕЧАНИЕ: Никогда не оставляйте мать без щенков в клетке. Вся процедура (от удаления щенка из его littermates, пока он не будет возвращен) должна длиться менее 10 минут. 5. Инъекции клозапин-Н-оксида Приготовьте лиганд DREADD, скусиный раствор CNO, разбавив 1 мг CNO в 50 л диметилсульксида (DMSO) до тех пор, пока раствор не будет полупрозрачным. Пополнить до 10 мл сольным раствором, так что конечная концентрация CNO составляет 0,1 мг/мл.ПРИМЕЧАНИЕ: ДМСО токсичен. Избегайте использования его с концентрацией выше 0,1%. Используйте в качестве элемента контроля соленом, содержащий ту же концентрацию DMSO, что и cNO, содержащий раствор. С постнатального дня 14 и в течение 3 constitutively дней (P14-P16), в каждой мыши выполнять две интраперитонеальные (I.P.) инъекции CNO (концентрация CNO: 1 мг/кг) или 0,05% DMSO в сольников, в день, 12 ч друг от друга. В последний день (P17), выполнить одну инъекцию и жертвовать мышей шейки матки дислокации в течение времени окно 30 мин-1 ч.