Vigilancia mejorada de la rabia mediante una prueba inmunohistoquímica rápida directa

Cada persona que realice pruebas diagnósticas de rabia debe recibir una serie estándar de vacunación contra la rabia previa a la exposición y someterse a una evaluación regular de anticuerpos serológicos, con vacunas de refuerzo según sea necesario. Las personas no inmunizadas no deben entrar en laboratorios o áreas donde se lleve a cabo dicho trabajo. Toda manipulación de tejidos y diapositivas debe llevarse a cabo para no aerosolizar líquidos o producir partículas en el aire. Las campanas de humo no son necesarias, pero cuando es posible pueden proporcionar protección adicional contra olores, ectoparásitos y fragmentos óseos. El equipo de protección personal mínimo, incluidos los guantes y la protección ocular, debe usarse en todo momento durante la recolección y las pruebas de la muestra. 1. Colección de troncos cerebrales Recoger muestras de tronco cerebral inmediatamente después de la recolección de cadáveres o asegurarse de que las canales se colocan en los congeladores para su almacenamiento hasta su posterior ensayo. Si se congelan las canales de los animales, descongele a temperatura ambiente antes de la recolección del tronco encefálico para facilitar la recolección. En algunas circunstancias, las muestras se recogen directamente de un animal congelado. Para los animales recién recogidos o descondesunidos a temperatura ambiente, coloque el animal supino sobre una superficie plana con la columna cervical ligeramente girada hacia el examinador. Palpate para identificar la articulación atlanto-occipital en el aspecto lateral de la columna cervical. Para las canales que todavía están completamente congeladas, coloque el animal supino como se describió anteriormente, si es práctico. Utilice sierras, cuchillos, cizallas óseas o equipos similares para separar completamente la cabeza del cuerpo.NOTA: Todos los equipos utilizados que no sean de un solo uso deben limpiarse a fondo entre las muestras. Usando una cuchilla de bisturí, haga una incisión a nivel de la articulación atlanto-occipital en el aspecto ventral, cortando a través de todas las capas de músculo y tejido blando, incluyendo la tráquea y el esófago. Continúe hasta aproximar el aspecto anterior de las vértebras de la columna cervical. Para el tejido congelado, utilice una cuchilla de bisturí para eliminar las capas restantes de músculo y tejido blando para exponer el foramen magnum. Mueva la cabeza del animal a una extensión de rango final hasta que el tronco encefálico sea visible. Utilice una cuchilla de bisturí para eliminar todo el tejido visible del tronco encefálico/sistema nervioso central (SNC) para el muestreo. Para una muestra congelada, usa una cuchilla de bisturí para extraer la mayor cantidad posible de tejido del tronco encefálico/SNC congelado del interior del cráneo. Coloque las muestras del tronco encefálico en un recipiente irrompible (es decir, latment metálico, criovial, etc.) y etiquete en consecuencia. Asegúrese de que las muestras del tronco encefálico se prueban inmediatamente después de la recolección a través de la prueba DRIT, refrigeradas (4 oC) durante un máximo de 24 horas antes de la prueba, o congeladas (-20 oC) hasta el momento de la prueba si las pruebas se llevarán a cabo más de 24 horas después de la recolección de la muestra. 2. Preparación de materiales para DRIT Configuración de 10 platos de tinción de diapositivas (Figura 1)NOTA: Los platos de tinción son lo suficientemente profundos como para permitir una inmersión completa de la corredera (diámetro 96 mm, altura 72 mm, profundidad 42 mm, volumen 250 mL). 6 Llene el plato 1 con una formalina tamponada al 10% de fosfato. Reemplace formalina después de 2 pruebas o semanalmente. Llene los platos 2, 4 y 5 con solución salina tamponada de fosfato con 1% de entreten-80 (TPBS). Reemplace con TPBS nuevo antes de cada prueba. Llene el plato 3 con 3% de peróxido de hidrógeno. Reemplace el peróxido de hidrógeno antes de cada prueba. Llene los platos 6, 8, 9 y 10 con agua destilada o desionizada. Reemplace el agua antes de cada prueba. Llene el plato 7 con la formulación de hematoxilina Gills #2 diluye en una proporción de 1:1 en agua destilada6. Reemplace la hematoxilina después de 2 pruebas o semanalmente.NOTA: De acuerdo con el protocolo DRIT original desarrollado por el CDC12, se puede utilizar una proporción de 1:2 de hematoxilina Gills al agua si el contramanchado es demasiado oscuro. Preparación de la solución en stock de amino-etilcarbazol (AEC) Con una pipeta de vidrio, coloque 5 ml de N,N-dimetilformamida en un recipiente de vidrio. Añadir un comprimido de 20 mg de 3-amino-9-etilcarbazol y agitar hasta que se disuelva por completo. Etiquete el frasco con “AEC stock” y la fecha en que se hizo el stock.NOTA: La solución de material AEC puede almacenarse bajo refrigeración (4 oC) y utilizarse durante 1-2 meses. Preparación de la dilución de trabajo de AEC Añadir 7 ml de tampón de acetato a un tubo centrífugo de 15 ml. Con una pipeta de vidrio, añada 0,5 ml de la solución de material AEC al tubo centrífugo. Añadir 0,075 ml de 3% de peróxido de hidrógeno al tubo. Filtrar la solución con una jeringa de 10 ml utilizando un filtro de jeringa de 0,45 m.NOTA: La dilución de trabajo AEC debe crearse justo antes de cada prueba DRIT, ya que sólo es estable durante 2-3 h. 3. Prueba rápida directa de inmunohistoquímica Etiquete los portaobjetos de microscopio de vidrio con un número único para cada espécimen utilizando un marcador de tinta permanente, impermeable y a prueba de manchas. Con una cuchilla de bisturí, retire el tronco encefálico del recipiente y colóquelo sobre una toalla de papel. Borre suavemente cualquier exceso de líquido, sangre o piel con una segunda toalla de papel para revelar sólo el tejido del tronco cerebral13. Si es necesario, seccione el tejido del tronco encefálico para revelar una sección transversal. Toque muy suavemente la diapositiva del microscopio hasta la sección transversal del tejido del tronco encefálico. Toque la diapositiva hasta el tronco encefálico en varios puntos sin movimiento lateral para permitir que varias áreas del tronco encefálico se transfieran a la diapositiva13. Asegúrese de que solo 1 o 2 capas de células se transfieren del tejido cerebral a la diapositiva con un toque suave. No se necesita ningún agente de montaje para fijar el tejido del tronco encefálico en las diapositivas. Incluya un control positivo y negativo en cada ejecución de DRIT. Deje que los portaobjetos se sequen al aire durante aproximadamente 5 minutos a temperatura ambiente. Sumerja los portaobjetos en una formalina tamponada del 10% durante 10 min (plato 1). Retire los portaobjetos de la formalina y enjuague en una solución de TPBS (plato 2). Sumergir los portaobjetos en peróxido de hidrógeno al 3% durante 10 min (plato 3). Retire los portaobjetos del peróxido de hidrógeno y enjuague en TPBS fresco (plato 4). Después de eliminar el exceso de peróxido de hidrógeno, coloque los portaobjetos en TPBS fresco (plato 5) y trabaje con una diapositiva a la vez mientras las otras diapositivas permanecen inmersas en TPBS. Tome los portaobjetos de TPBS (plato 5) uno a la vez, sacuda y destruya el exceso de tampón, y colóquelos sobre una toalla de papel humedecida en el banco de laboratorio, como base de una “cámara de humedad”. Con una pipeta, suelte suficiente anticuerpo primario contra el virus antirrábico en cada diapositiva para cubrir el tejido del SNC. Incubar los portaobjetos durante 10 minutos en la cámara de humedad (es decir, cubrir los portaobjetos con placas de pozo u otra cubierta simple mientras se colocan sobre la toalla de papel humedecida) a temperatura ambiente (Figura2). Retire los portaobjetos de la cámara de humedad, agite y elimine el exceso de conjugados y enjuague los portaobjetos en TPBS (reutilice el mismo TPBS en el plato 5). Trabajando con una diapositiva a la vez, mientras que otros permanecen inmersos en TPBS — usa una pipeta para dejar caer suficiente complejo de esptavidina-peroxidasa para cubrir el tejido del SNC. Incubar en la cámara de humedad durante 10 min a temperatura ambiente. Retire los portaobjetos de la cámara de humedad, agite y elimine el exceso de complejo, y enjuague los portaobjetos en TPBS (plato 5). Trabajar con una diapositiva a la vez, sacudir y borrar el exceso de tampón, mientras que otros permanecen inmersos en TPBS – utilizar una pipeta para dejar caer suficiente AEC (la preparación se explica anteriormente y debe hacerse inmediatamente antes de su uso) para cubrir el tejido del SNC. Incubar en la cámara de humedad durante 10 min a temperatura ambiente. Enjuague los portaobjetos en agua destilada (plato 6). Coloque los toboganes en contramancha de Gills Hematoxylin (diluido 1:1 con agua destilada) durante 2 min (plato 7). Enjuague inmediatamente todos los portaobjetos en agua destilada (plato 8). Repita dos veces con agua dulce cada vez (platos 9 y 10). Trabajando con un tobogán a la vez, mientras que otros permanecen sumergidos en agua destilada (plato 10) — agitar y borrar el exceso de agua y utilizar un medio de montaje soluble en agua para fijar un resbalón de la cubierta. Utilice un microscopio de luz con un objetivo de 20x para ver las diapositivas y un objetivo 40x si se necesita una inspección más detallada.