Verbesserte Tollwutüberwachung mit einem direkten schnellen immunhistochemischen Test
Summary
Der direkte schnelle immunhistochemische Test (DRIT) bietet eine anerkannte Alternative zur direkten fluoreszierenden Antikörper-Diagnose (World Organization for Animal Health and World Health Organization(Who). Dieser Test ermöglicht feldbasierte Anwendungen, die bei Hirnabdrücken mit Hilfe der Lichtmikroskopie in ca. 1 h durchgeführt werden können.
Abstract
Laborbasierte Überwachung ist integraler Bestandteil der Tollwutprävention, -bekämpfung und -bewirtschaftung. Obwohl das DFA der Goldstandard für die Tollwutdiagnose ist, müssen zusätzliche Diagnoseverfahren validiert werden, um die Tollwutüberwachung zu verbessern, insbesondere in Entwicklungsländern. Hier stellen wir ein Standardprotokoll für das DRIT als alternative, labor- oder feldbasierte Testoption vor, die Lichtmikroskopie im Vergleich zum DFA verwendet. Berührungsabdrücke von Hirngewebe, das von verdächtigen Tieren gesammelt wurde, werden in 10% gepuffertem Formalin fixiert. Das DRIT verwendet tollwutvirusspezifische monoklonale oder polyklonale Antikörper (konjugiert zu Biotin), ein Streptavidin-Peroxidase-Enzym und einen Chromogen-Reporter (wie Acetyl 3-Amino-9-Ethylcarbazol), um virale Einschlüsse in infiziertem Gewebe zu erkennen. In ca. 1 h kann eine Hirngewebeprobe vom DRIT getestet und interpretiert werden. Die Bewertung verdächtiger Tierhirne, die aus einer Vielzahl von Arten in Nordamerika, Asien, Afrika und Europa getestet wurden, hat gezeigt, dass die DRIT mit den Ergebnissen im Vergleich zu DFA an 100 % heranrückt. Seit 2005 hat das Programm Wildlife Services (USDA WS) des US-Landwirtschaftsministeriums umfangreiche verstärkte Tollwutüberwachungsmaßnahmen durchgeführt, bei denen das DRIT >94.000 Proben aus Wildtieren in strategischen Tollwut-Managementgebieten getestet wurde. . Das DRIT bietet ein leistungsfähiges, wirtschaftliches Werkzeug für die Tollwutdiagnose, das von Laboratoren und Feldbiologen genutzt werden kann, um aktuelle Tollwutüberwachungs-, Präventions- und Kontrollprogramme weltweit zu verbessern.
Introduction
Während das DFA der am weitesten verbreitete Test für routinemäßige Tollwutdiagnose1ist, können die Kosten für den Kauf und die Wartung eines Fluoreszenzmikroskops auf Entwicklungsländer 2,3,4 und für breite, groß angelegte erweiterte Tollwut-Überwachungsprogramme3,4. Darüber hinaus erfordert das DFA die Fähigkeit, Proben während der Fixierung zu kühlen und Proben über der Umgebungstemperatur während der Antikörper-Antigen-Reaktionen zu inkubieren, was in Ländern ohne geeignete Infrastruktur eine erhebliche Hürde darstellen kann. Teilweise aufgrund der Einschränkungen, die mit modernen DFA-Tests verbunden sind, ist die globale Auswirkung von Tollwut seit langem unterschätzt5.
In dieser Hinsicht müssen zusätzliche Diagnosetechniken validiert werden, um die Tollwutüberwachung weltweit zu verbessern, insbesondere in Entwicklungsländern. Das hier vorgestellte DRIT-Protokoll bietet eine Labor- oder feldgestützte Testalternative zum DFA, die Lichtmikroskopie verwendet und während des Tests6keine Kühlung oder Laborinkubation erfordert. Die DRIT und DIE DFA ähneln sich insofern, als beide Techniken Berührungsabdrücke von Gehirnproben verwenden, die von potenziell rabiaten Tieren gesammelt wurden. Im ersten Schritt des DRIT wird formalin jedoch als historisches Fixativ für Proben verwendet, das das Tollwutvirus inaktiviert. Dies bietet eine wesentliche Verbesserung der Biosicherheit gegenüber dem Aceton, das zur Fixierung von Proben im DFA-Protokoll3verwendet wird, was nicht nur im Labor wichtig ist, sondern vielleicht noch mehr in feldbasierten oder dezentralen Laborumgebungen. Bis heute zeigt das DRIT Empfindlichkeit und Spezifität gleich dfA2,7,8,9.
Seit 2005 hat das USDA WS-Programm in Nordamerika umfangreiche verstärkte Tollwutüberwachungsbemühungen durchgeführt, indem das DRIT als Teil eines umfassenden Programms zur Bewirtschaftung von Tollwut in der Tierwelt verwendet wird10. Verbesserte Tollwut-Überwachung wird als Ergänzung zu expositionsbasierten öffentlichen Gesundheitsüberwachung verwendet und testet in erster Linie Wildtiere meso-carnivore Arten, einschließlich Waschbären (Procyon Lotor), gestreifte Skunks (Mephitis mephitis), grau Füchse ( Urocyon cinereoargenteus), Rotfüchse (Vulpes vulpes) und Kojoten (Canis latrans), die nicht an einer Exposition von Menschen oder Haustieren beteiligt waren. Tierkörper, die in Tests verwendet wurden, wurden der USDA WS durch verstärkte Tollwutüberwachungsbemühungen vorgelegt und umfassten Tollwutvektorarten, die: krank oder seltsam wirken; tot aufgefunden, auf der Straße getötet oder lästig; und nicht mit einer Exposition von Menschen oder Haustieren in Verbindung gebracht werden. Das DRIT bietet einen Tollwutdiagnostiktest an, der von ausgebildeten Feldbiologen mit wenig oder gar keiner Laborerfahrung eingesetzt werden kann, um die Tollwutüberwachung zu verbessern und die finanzielle Belastung und Arbeitsbelastung von Diagnoselaboratorien für die öffentliche Gesundheit zu verringern10. Die grundlegende DRIT-Schulung für USDA WS-Außendienstmitarbeiter dauert in der Regel 1,5 bis 2 Tage, was ca. 4 h Unterricht im Klassenzimmer umfasst, der die Grundprinzipien der Biosicherheit, Methoden für die Probenentnahme und die DRIT-Prozesse sowie >8 h von umfasst. Laborzeit bei der Durchführung des Tests. Über die Centers for Disease Control and Prevention (CDC), LYSSA LLC und das Wistar Institute wurden den USDA WS und Programmkoordinatoren Schulungsmöglichkeiten zur Verfügung gestellt.
In strategischen Managementbereichen hat USDA WS über 94.000 Wildtierproben mit dem DRIT getestet und mehr als 1.850 tollwütigen Proben entdeckt, die wahrscheinlich unentdeckt geblieben wären, die sich nur auf Expositionstests auf der Grundlage von Tests der öffentlichen Gesundheit von verdächtigen Tieren beruhe. Verbesserte Tollwutüberwachungsdaten, die von DRIT-Ergebnissen bereitgestellt werden, sind entscheidend für eine vollständigere zeitliche und räumliche Darstellung von Tollwut auf der Landschaft zur Unterstützung oraler Tollwut-Impfprogramme für Wildtiere in den USA10, 11. In ähnlicher Weise haben die kanadischen Wildtierbehörden DRIT in groß angelegte Maßnahmen zur Überwachung von Tollwut in großem Stil in Verbindung mit ihren Programmen im Bereich der öffentlichen Gesundheit mit Erfolgintegriert 8. Sowohl USDA WS als auch kanadische DRIT-Überwachungsprogramme haben nationale Referenzlaboratorien verwendet, um Tollwut durch DFA zu bestätigen und virale Variantentypisierung nach Bedarfdurchzuführen 8. Darüber hinaus senden USDA WS-Feldbiologen 10 % der negativen Proben zur DFA-Bestätigung an Referenzlaboratorien und nehmen seit 2008 an halbjährlichen DRIT-Kompetenztests teil, die vom Wisconsin State Laboratory of Hygiene als Teil der Standard-Laboratoriumfürarbeitung durchgeführt wurden. Qualitätssicherungsmaßnahmen.
Ziel dieser Methode ist es, einen alternativen Ansatz für Tollwutdiagnostiktests anzubieten, der in dezentralen Laboratorien, im Feld oder in Bereichen ohne routinemäßigen Zugang zur Elektronenmikroskopie durchgeführt werden kann.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das DRIT ist eine flexible Methode zur feldbasierten Überwachung zum Nachweis des Vorhandenseins von Tollwutviren, die in dezentralen Laborbereichen eingesetzt werden können. Während es möglich ist, den gesamten Test in einer feldbasierten Umgebung durchzuführen, z. B. an der Heckklappe eines LKWs, ist es ideal, einen kleinen Raum für DRIT aufgrund von Chemikalien-, Ausrüstungs- und Versorgungsproblemen zu haben. Darüber hinaus muss die Einhaltung aller geltenden Bundes-, Landes- und Kommunalgesetze sowie Vorschriften für den chemischen Einsatz und die Entsorgung berücksichtigt werden. Derzeit verfügt USDA WS über 15 DRIT-Einrichtungen, um Proben aus 17 Bundesstaaten zu testen. Die USDA WS DRIT-Einrichtungen werden in Zusammenarbeit mit Universitanten und staatlichen Laboratorien für das öffentliche Gesundheitswesen, in ausgewiesenen Räumen in größeren Einrichtungen und in geschlossenen Anhängern, die nachgerüstet und umgebaut wurden, um als mobile Prüfgeräte in der Im Falle einer Notfallreaktion auf Ausbrüche, bei der verbesserte Tollwutüberwachungstests mit sofortiger Durchlaufzeit von entscheidender Bedeutung sind (Abbildung 5).
Während der Test erfolgreich mit Hirnstammmaterial von variabler Qualität war, ist frisches Hirnstammgewebe ohne Gewebezersetzung optimal. Wenn Zersetzung, Austrocknung oder Verflüssigung auftritt, nimmt die Probenqualität ab, und der Test kann eine unspezifischere Färbung erkennen, die die Ergebnisse verwirren kann. Diese Beobachtung ist ähnlich zwischen DFA und DRIT2. Brainstem/CNS sollte so schnell wie möglich gesammelt und dann bis zum Test gefroren (-20 °C) gelagert werden.
In der Regel verarbeiten die meisten USDA WS-Einrichtungen während einer DRIT-Sitzung 12 bis 24 Folien gleichzeitig, einschließlich einer positiven und einer negativen Kontrolle, die über DFA bestätigt wurden. Positive und negative Kontrollen stellen einen Bezugspunkt für jeden DRIT-Lauf bereit, um sicherzustellen, dass der Test erfolgreich war, und um zu bestätigen, ob auf den Testfolien Interpretationsfragen auftreten. Wenn eine Probe nicht als eindeutig positives oder negatives Ergebnis bestimmt wird, wird sie als unbestimmt gekennzeichnet und ein zweites Mal von DRIT getestet. Wenn diese Probe nach zwei DRIT-Tests nicht eindeutig positiv oder negativ ist, wird sie an ein Referenzlabor für DFA- oder verwandte Tests gesendet.
Wie bei jedem diagnostischen Test ist “Trouble-Shooting” bei unerwarteten Befunden nützlich. Wenn z. B. ein DRIT-Lauf erfolglos ist (d. h., die Positivkontrolle weist keine +3 oder +4-Färbungsintensität und Antigenverteilung auf), stellen Sie sicher, dass alle Chemikalien und Reagenzien nicht abgelaufen sind. Wir haben festgestellt, dass die Verwendung einer neu geöffneten Flasche Wasserstoffperoxid mindestens einmal pro Woche hilfreich ist, um unspezifische Färbung durch Oxidation des Hirngewebes zu verhindern. Darüber hinaus empfehlen wir, den Acetatpuffer mindestens einmal jährlich mindestens einmal zu ersetzen, unabhängig vom markierten Ablaufdatum.
Es gibt eine Reihe von Vorteilen des DRIT gegenüber DFA, darunter niedrigere Kosten, die Möglichkeit, den Test außerhalb eines zentralen Labors durchzuführen, die Notwendigkeit nur der Lichtmikroskopie anstelle eines Fluoreszenzmikroskops und der relativ einfache Schulungsprozess für Personen, die den Test verwalten und lesen2,3,4. Diese Vorteile, gepaart mit der Empfindlichkeit und Spezifität des DRIT, die mit DFA2,7,8,9 vergleichbar sind, haben bereits bewiesen, dass der Test als wichtiges Werkzeug in großem Maßstab dient verbesserte Tollwut-Überwachungsprogramme8,10 in Nordamerika. Darüber hinaus hat das DRIT das Potenzial, eine verstärkte Überwachung und schnellere Tests in Entwicklungsländern oder anderen Gebieten mit begrenzten Ressourcen zu ermöglichen, insbesondere nach den jüngsten OIE/WHO-Leitlinien als empfohlener Test.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir würdigen alle Mitarbeiter von USDA Wildlife Services, die derzeit oder zuvor verbesserte Tollwut-Überwachungsproben gesammelt haben und das DRIT für die Tollwutdiagnose durchgeführt haben. Ebenso würdigen wir die vielen Kooperationspartner, die uns bei der Sammlung “Enhanced Tolles Surveillance” unterstützen. Wir danken auch den Centers for Disease Control and Prevention und dem Wistar Institute für den Zugang zu kritischen Reagenzien, die für die Durchführung des DRIT erforderlich sind, und für die Bereitstellung von Schulungsmöglichkeiten. Darüber hinaus schätzen wir die Bestätigungsdiagnostik und technische Unterstützung durch die Centers for Disease Control and Prevention und das Wadsworth Center mit dem New York State Department of Health. Die Verwendung kommerzieller Produkte dient nur zu Vergleichszwecken und stellt keine Billigung dar.
Materials
| 3-Amino-9-Ethylcarbazole (AEC tablets; 50 count) | Sigma Aldrich (https://www.sigmaaldrich.com/) | A6926 | |
| Acetate Buffer, 0.1M, 5.2 pH, 32oz | Poly Scientific R&D Corp. (https://www.polyrnd.com/) | s140 | |
| Ag Tek MiniScalpel, PN110, Non-sterile #10, 40 per package | Patterson Veterinary (https://www.pattersonvet.com/) | PN110 | Supplemental equipment for sample touch impressions; Also available through Clipper Distributing (http://www.clipperdist.net/) |
| BD Luer-Lok Disposable Syringe without needle, 10cc | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | 14-823-2A | BD Manufacturer Number 309604 |
| Binocular Light Microscope with Seidentopf Head or equivalent | Multiple Vendors | ||
| Blue Rectangular UN-rated Disposal Container, 5G | Berlin Packaging (https://www.berlinpackaging.com/) | 1147T01BLU | Supplemental equipment for chemical waste storage/disposal (Gill hematoxylin and AEC solution) |
| Corning Square and Rectangular Cover Glass, 24×60 | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | 12-553-465 | Corning Manufacturer Number 2975246 |
| Corning Universal Fit Pipet Tips: Racked, Nonsterile (1-200ul) | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | 07-200-300 | Corning Manufacturer Number 4863 |
| Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes, polypropylene | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | 14-959-70C | Corning Manufacturer Number 352097 |
| Falcon 96-Well Assay Plates (Tissue culture plate lids) | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | 08-772-5 | Corning Manufacturer Number 353910 |
| Fisher Brand 25mm Syringe Filter, Nylon, 0.45um, Sterile | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | 09-719D | |
| Fisher Chemical Gill Method Hematoxylin Stain (Gill-2), 4L | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | CS401-1D | |
| Fisherbrand Sharps-A-Gator Point-of-Use Sharps Containers, 5qt | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | 14-827-122 | Supplemental equipment for proper BSL-2 Laboratory Set-Up |
| Fluoro-Gel with Tris Buffer (Gel/Mount Media), 20mL | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 102092-122 | Fluoro-Gel Substitute for BioMeda™ Gel-Mount, Electron Microscopy Sciences |
| Formalin, Buffered, 10%, 4L | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | SF100-4 | Available each or in case of 4 |
| Gilson Pipetman P200 Pipet, 50-200uL | Daigger Scientific (https://www.daigger.com) | EF9930E | |
| Hy-Clone Phosphate Buffered Saline, 1X Solution, 1L (PBS) | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | SH30256LS | Alternative dry powder product can be used |
| Hydrogen Peroxide, 3% | Multiple Vendors | Any commercially available source, such as pharmacy or store brands, etc. | |
| Lens Microscope Objective 20X and 40X | Multiple Vendors | ||
| Lysol IC Quarternary Disinfecting Cleaner, 1G | Daigger Scientific (https://www.daigger.com) | EF8481 | Supplemental materials for proper BSL-2 Laboratory disinfection |
| Miltex brand Disposable Scalpel Size 22 (alternative size to MiniScalpel) | AMD Next (www.amdnext.com) | 999112314 | Supplemental equipment for sample touch impressions; Alternative size to Ag Tek MiniScalpel |
| N,N-Dimethylformamide, Amber Glass Packaging, 500mL | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | D119-500 | |
| Peroxidase Labeled Streptavidin, 50mL | SeraCare (https://www.seracare.com/) | 5550-0001 | KPL Immunoassay and Kits Reference Number 71-00-38 |
| Phosphate Buffered Saline Powder (alternative to Fisher liquid PBS) | Sigma Aldrich (https://www.sigmaaldrich.com/) | P3813 | Must be prepared in 1L distilled water; Available in quantities of 1, 10 and 50 packs |
| Primary antibody: Polyclonal anti-nucleoprotein or cocktail of anti-lyssavirus biotinylated antibodies | Store at 4 degrees C | ||
| PYREX Disposable Serological Pipets, Glass, Sterile, Plugged, Corning, 1.0mL | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 7078D-1 | VWR Manufacturer Number 89091-220 |
| PYREX Disposable Serological Pipets, Glass, Sterile, Plugged, Corning, 10.0mL | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 7078D-10 | VWR Manufacturer Number 89091-106 |
| PYREX Disposable Serological Pipets, Glass, Sterile, Plugged, Corning, 5.0mL | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 7078D-5 | VWR Manufacturer Number 89091-484 |
| Richard-Allan Scientific Gills Hematoxylin Stain No. 2, 1PT (alternative to above) | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | 22-050-201 | Thermo Scientific Manufacturer Number 72504 |
| Slide Holders, 24-place | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 25608-868 | Sakura®Finetek Supplier Number 4465; Available through multiple vendors |
| Specimen Tin Boxes, 1/2oz | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 101412-452 | Supplemental equipment for storage of brain tissue samples |
| Taylor 2-Event Digital Timer/Clock | Multiple Vendors | Supplemental equipment | |
| Tissue-Tek Slide Staining Kit | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 25608-902 | Sakura®Finetek Supplier Number 4551; Available through multiple vendors |
| TWEEN 80, Polyethylene glycol, 500mL | Sigma Aldrich (https://www.sigmaaldrich.com/) | P1754 | Also available in 25mL, 1L and 1G volumes |
| VWR FLIP Pipette Filler (0.05-100mL) | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 53497-055 | |
| VWR Soft Nitrile Examination Gloves, L (100 per box) | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 89038-272 | Supplemental equipment for proper PPE |
| Water, Deionized (20L) | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 10806-022 | |
| Wheaton Clear Glass Sample Vials, 8mL | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | 06-408C | DWK Life Sciences Manufacturer Number 224884 |
| White Coated, Double Well Pattern Microscope Slides, 14mm | Tekdon Incorporated (https://www.tekdon.com/coated-microscope-slides.html) | 2-140 | |
| White Rectangular UN-rate Disposal Container, 5G | Berlin Packaging (https://www.berlinpackaging.com/) | 1147T01WHT | Supplemental equipment for chemical waste storage/disposal (Formalin) |
References
- Dean, D. J., Abelseth, M. K., Atanasiu, P., Meslin, F. X., Kaplan, M. M., Koprowski, H. . Laboratory techniques in rabies. 23, (1996).
- Durr, S., et al. Rabies diagnosis for developing countries. PLOS Neglected Tropical Diseases. 2 (3), e206 (2008).
- Rupprecht, C., et al. . Progress in the development of a direct rapid immunohistochemical test for diagnosing rabies. , (2014).
- Rupprecht, C. E., et al. Additional Progress in the Development and Application of a Direct, Rapid Immunohistochemical Test for Rabies Diagnosis. Journal of Veterinary Science. 5 (2), (2018).
- Coleman, P. G., Fevre, E. M., Cleaveland, S. Estimating the public health impact of rabies. Emerging Infectious Diseases. 10 (1), 140-142 (2004).
- . . Standard Operating Procedure for the Direct Rapid Immunohistochemistry Test (DRIT) for the detection of rabies virus antigens. , (2016).
- Lembo, T., et al. Evaluation of a direct, rapid immunohistochemical test for rabies diagnosis. Emerging Infectious Diseases. 12 (2), 310-313 (2006).
- Middel, K., Fehlner-Gardiner, C., Pulham, N., Buchanan, T. Incorporating Direct Rapid Immunohistochemical Testing into Large-Scale Wildlife Rabies Surveillance. Tropical Medicine and Infectious Disease. 2 (3), 21 (2017).
- Coetzer, A., Sabeta, C. T., Markotter, W., Rupprecht, C. E., Nel, L. H. Comparison of biotinylated monoclonal and polyclonal antibodies in an evaluation of a direct rapid immunohistochemical test for the routine diagnosis of rabies in southern Africa. PLOS Neglected Tropical Diseases. 8 (9), e3189 (2014).
- Kirby, J., et al. Enhanced Rabies Surveillance to Support Effective Oral Rabies Vaccination of Raccoons in the Eastern United States. Tropical Medicine and Infectious Disease. 2 (3), 34 (2017).
- Slate, D., et al. Oral rabies vaccination in north america: opportunities, complexities, and challenges. PLOS Neglected Tropical Diseases. 3 (12), e549 (2009).
- . Direct Rapid Immunohistochemistry Test (DRIT) protocols Available from: https://rabiessurveillanceblueprint.org/Direct-Rapid-Immunohistochemistry?lang=fr (2019)
- Khalid, A., Haque, A. . Touch Impression Cytology Versus Frozen Section as Intraoperative Consultation Diagnosis. 2, (2004).
