Verbeterde bewaking van rabiës met behulp van een directe snelle immunohistochemische test
Summary
De directe Rapid immunohistochemische test (DRIT) biedt een Wereldorganisatie voor diergezondheid en Wereldgezondheidsorganisatie (OIE/WHO) erkend alternatief voor de direct fluorescent antilichaam (DFA) test voor de diagnose van rabiës. Deze test maakt het mogelijk voor veld-gebaseerde toepassingen die kunnen worden uitgevoerd in ongeveer 1 h na hersen vertoningen met behulp van Lichtmicroscopie.
Abstract
Laboratorium toezicht is een integraal onderdeel voor preventie, controle en beheer van rabiës. Hoewel de DFA de gouden standaard is voor de diagnose van rabiës, is het noodzakelijk om aanvullende diagnostische technieken te valideren om het toezicht op rabiës te verbeteren, met name in ontwikkelingslanden. Hier presenteren we een standaardprotocol voor de DRIT als een alternatieve, laboratorium of veld-gebaseerde test optie die Lichtmicroscopie gebruikt in vergelijking met de DFA. Aanraking indrukken van hersenweefsel verzameld van verdachte dieren zijn vastgesteld in 10% gebufferde formalin. De DRIT gebruikt rabiësvirus-specifieke monoklonale of Polyklonale antilichamen (geconjugeerd met biotine), een streptavidin-peroxidase enzym, en een chromogeen Reporter (zoals acetyl 3-amino-9-ethylcarbazol) om virale insluitsels binnen geïnfecteerd weefsel te detecteren. In ongeveer 1 uur kan een hersenweefsel monster worden getest en geïnterpreteerd door de DRIT. Evaluatie van verdachte dierlijke hersenen getest uit een verscheidenheid van soorten in Noord-Amerika, Azië, Afrika, en Europa hebben geïllustreerd hoge gevoeligheid en specificiteit door de DRIT naderen 100% met resultaten in vergelijking met DFA. Sinds 2005, het Amerikaanse ministerie van landbouw Wildlife Services (USDA WS) programma heeft grootschalige versterkte rabiës surveillance inspanningen uitgevoerd met behulp van de DRIT te testen > 94000 monsters verzameld uit de natuur in strategische rabiës beheer gebieden . De DRIT biedt een krachtig, zuinig hulpmiddel voor de diagnose van rabiës, dat door laboratorianen en veld biologen kan worden gebruikt om de huidige bewakings-, preventie-en controleprogramma’s van de rabiës wereldwijd te verbeteren.
Introduction
Hoewel de DFA de meest gebruikte test is voor routine rabiës diagnose1, kunnen de aanschaf-en onderhoudskosten van een fluorescerende Microscoop worden beperkt tot ontwikkelingslanden2,3,4 en voor brede, grootschalige versterkte rabiës surveillance Programma’s3,4. Bovendien vereist de DFA de mogelijkheid om monsters te koelen tijdens de fixatie en om monsters boven de omgevingstemperatuur te inbrotsen tijdens de antilichaam-antigeen reacties, wat een aanzienlijke hindernis kan zijn in landen zonder geschikte infrastructuur. Vanwege de beperkingen in verband met moderne DFA-testen, is de wereldwijde impact van hondsdolheid al lang onderschat5.
In dit verband is het noodzakelijk om aanvullende diagnostische technieken te valideren om het toezicht op rabiës wereldwijd te verbeteren, met name in ontwikkelingslanden. Het hier gepresenteerde DRIT-protocol biedt een laboratorium of veld-gebaseerd test alternatief voor de DFA die Lichtmicroscopie gebruikt en geen koeling of laboratorium incubatie nodig heeft tijdens de test6. De DRIT en DFA zijn vergelijkbaar in dat beide technieken Touch indrukken van hersen monsters verzameld uit mogelijk rabiate dieren gebruiken. Echter, de eerste stap van de DRIT gebruikt formaline als een historische fixeermiddel voor monsters, die rabiësvirus inactiveert. Dit zorgt voor een substantiële bioveiligheid verbetering ten opzichte van de aceton gebruikt om monsters te repareren in het DFA protocol3, dat is belangrijk niet alleen in het laboratorium, maar misschien nog meer in het veld-gebaseerde of gedecentraliseerde lab-omgevingen. Tot op heden toont de DRIT gevoeligheid en specificiteit gelijk aan de DFA2,7,8,9.
Sinds 2005 heeft het USDA WS programma grootschalige versterkte rabiës surveillance-inspanningen in Noord-Amerika uitgevoerd met behulp van de DRIT als onderdeel van een uitgebreid Wildlife rabiës Management programma10. De verscherpte bewaking van rabiës wordt gebruikt als aanvulling op op blootstelling gebaseerde volksgezondheids surveillance en-tests, voornamelijk in de fauna Meso-Carnivore soorten, waaronder wasberen (Procyon lotor), gestreepte Stink (Mephitis mephitis), Gray Foxes ( Urocyon cinereoargenteus), Rode Vossen (Vulpes vulpes) en coyotes (Canis latrans) die niet betrokken zijn geweest bij een blootstelling aan mens of huisdier. Dier karkassen die in het onderzoek zijn gebruikt, zijn aan USDA WS verstrekt door middel van verbeterde surveillance-inspanningen voor rabiës en bestond uit rabiës vector soorten die: ziek of vreemd handelen; dood aangetroffen, weggedood of hinderlijk; en zijn niet geassocieerd met een blootstelling aan mens of huisdier. De DRIT geeft een rabiës diagnostische test die kan worden gebruikt door getrainde veld biologen met weinig of geen laboratorium ervaring om het toezicht op rabiës te verbeteren en de financiële last en de werklast van de diagnostische laboratoria voor de volksgezondheid te verminderen10. De Basic DRIT training voor USDA WS veld medewerkers duurt meestal 1,5 tot 2 dagen, die ongeveer 4 h van de klas instructie met betrekking tot de fundamentele principes van bioveiligheid, methoden voor monster inzameling en de DRIT processen, alsmede > 8 h van laboratorium tijd die de test uitvoert. Er zijn opleidingsmogelijkheden beschikbaar voor USDA WS en Program coopera tors via de centra voor ziektebestrijding en preventie (CDC), LYSSA LLC en het Wistar Institute.
Binnen strategische beheer gebieden heeft USDA WS meer dan 94.000 Wildlife monsters getest met behulp van de DRIT en heeft meer dan 1.850 rabiate monsters gedetecteerd die waarschijnlijk onopgemerkt zouden zijn gebleven, waarbij alleen werd uitgegaan van blootstelling op basis van openbare gezondheidstests van verdachte dieren. Versterkte rabiës surveillancegegevens verstrekt door DRIT resultaten zijn van cruciaal belang voor het bieden van een completere temporele en ruimtelijke representatie van rabiës op het landschap ter ondersteuning van orale rabiësvaccinatie Programma’s voor wilde dieren in de VS10, 11. Op dezelfde manier hebben provinciale natuur agentschappen in Canada DRIT in grootschalige Wildlife rabiës surveillance-inspanningen in tandem met hun volksgezondheidsprogramma’s met succes8opgenomen. Zowel USDA WS als Canadian DRIT surveillance Programma’s hebben nationale referentielaboratoria gebruikt om rabiës door DFA te bevestigen en een virale variant te typen die geschikt is voor8. Bovendien zenden USDA WS-veld biologen 10% van de negatieve specimens voor de bevestiging van DFA aan referentielaboratoria en sinds 2008, hebben deelgenomen aan tweejaarlijkse DRIT bekwaamheidsproeven die zijn verstrekt door het Wisconsin State Laboratory of Hygiene, als onderdeel van standaard maatregelen voor kwaliteitsborging.
Het doel van deze methode is om een alternatieve aanpak voor rabiës diagnostische tests die kunnen worden gedaan in gedecentraliseerde laboratoria, in het veld, of in gebieden zonder routine toegang tot elektronenmicroscopie bieden.
Protocol
Representative Results
Discussion
De DRIT is een flexibele methode die geschikt is voor veld-based Surveillance voor het opsporen van de aanwezigheid van rabiësvirus dat kan worden gebruikt in gedecentraliseerde laboratorium gebieden. Hoewel het mogelijk is om de hele test uit te voeren in een veld-gebaseerde setting zoals op de achterklep van een truck, is het ideaal om een kleine binnenruimte te hebben die is gewijd aan DRIT vanwege chemische, apparatuur en Supply-opslagproblemen. Daarnaast moet rekening worden gehouden met de naleving van alle toepasselijke federale, staats-en lokale wetten en voorschriften voor chemisch gebruik en verwijdering. Op dit moment heeft USDA WS 15 DRIT faciliteiten om samples uit 17 Staten te testen. De USDA WS DRIT-faciliteiten worden opgericht in samenwerking met de Universiteit en de staat volksgezondheids laboratoria, in aangewezen kamers binnen grotere faciliteiten en in gesloten aanhangwagens die zijn omgebouwd en geconverteerd om als mobiele testunits te dienen in de geval van een nood uitbraak reactie waarbij verscherpte rabiës surveillance tests met onmiddellijke doorlooptijd kritisch zijn (Figuur 5).
Hoewel de test succesvol is geweest met behulp van hersenstam materiaal van variabele kwaliteit, is vers hersenstam weefsel zonder weefsel ontleding optimaal. Als ontleding, uitdroging of vloeibaarmaking optreedt, neemt de monster kwaliteit af en kan de test meer niet-specifieke vlekken detecteren die de resultaten kunnen verwarren. Deze waarneming is vergelijkbaar tussen DFA en DRIT2. Hersenstam/CNS moet zo snel mogelijk worden verzameld en vervolgens bevroren (-20 °C) worden bewaard tot het testen.
Meestal verwerken de meeste USDA WS-faciliteiten in één keer van 12 tot 24 dia’s tijdens een DRIT sessie, inclusief één positieve controle en één negatieve controle die is bevestigd via DFA. Positieve en negatieve controles bieden een referentiepunt voor elke DRIT run om ervoor te zorgen dat de test geslaagd is en om te bevestigen of interpretatieve vragen op de test dia’s ontstaan. Als een monster niet is vastbesloten om een duidelijk positief of negatief resultaat te hebben, wordt het aangeduid als een onbepaalde en een tweede keer getest door DRIT. Als dit monster niet duidelijk positief of negatief is na twee DRIT tests, wordt het naar een referentielaboratorium voor DFA of verwant testen gestuurd.
Zoals bij elke diagnostische test is ‘ Trouble Shooting ‘ handig bij onverwachte bevindingen. Als een DRIT-run bijvoorbeeld niet lukt (d.w.z. de positieve controle vertoont geen + 3 of + 4 kleurings intensiteit en antigeen-verdeling), zorg er dan voor dat alle chemicaliën en reagentia niet zijn verlopen. We hebben gevonden met behulp van een nieuw geopende fles waterstofperoxide ten minste eenmaal per week is nuttig om te helpen voorkomen dat niet-specifieke kleuring door oxidatie van het hersenweefsel. Bovendien wordt u aangeraden acetaat-buffer ten minste eenmaal per jaar minimaal te vervangen, ongeacht de gelabelde vervaldatum.
Er zijn een aantal voordelen van de DRIT over DFA inclusief lagere kosten, de mogelijkheid om de test uit te voeren buiten een gecentraliseerd laboratorium, alleen Lichtmicroscopie nodig in plaats van een fluorescerende Microscoop, en het relatief eenvoudige trainingsproces voor mensen die de test2,3,4beheren en lezen. Deze voordelen, in combinatie met de gevoeligheid en specificiteit van de DRIT die vergelijkbaar zijn met DFA2,7,8,9 , hebben al bewezen dat de test als een belangrijk instrument op grote schaal dient versterkte rabiës surveillance Programma’s8,10 in Noord-Amerika. Daarnaast heeft de DRIT potentieel om meer surveillance en meer snelle tests mogelijk te maken in ontwikkelingslanden of andere gebieden met beperkte middelen, vooral na recente OIE/WHO-richtlijnen als een aanbevolen test.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij erkennen alle USDA Wildlife diensten personeel die momenteel of hebben eerder verzameld verbeterde rabiës surveillance monsters en hebben de DRIT voor rabiës diagnose uitgevoerd. Evenzo erkennen we de vele coopera toren die ons helpen met de uitgebreide surveillance collectie van rabies. We danken ook de centra voor ziektebestrijding en preventie en het Wistar Institute voor toegang tot kritische reagentia die nodig zijn om de DRIT te voeren en om opleidingsmogelijkheden te bieden. Daarnaast waarderen we de bevestigende diagnostiek en technische bijstand van de centra voor ziektebestrijding en preventie en door het Wadsworth Center met het New Yorkse State Department of Health. Het gebruik van commerciële producten is uitsluitend voor vergelijkingsdoeleinden en vormt geen goedkeuring.
Materials
| 3-Amino-9-Ethylcarbazole (AEC tablets; 50 count) | Sigma Aldrich (https://www.sigmaaldrich.com/) | A6926 | |
| Acetate Buffer, 0.1M, 5.2 pH, 32oz | Poly Scientific R&D Corp. (https://www.polyrnd.com/) | s140 | |
| Ag Tek MiniScalpel, PN110, Non-sterile #10, 40 per package | Patterson Veterinary (https://www.pattersonvet.com/) | PN110 | Supplemental equipment for sample touch impressions; Also available through Clipper Distributing (http://www.clipperdist.net/) |
| BD Luer-Lok Disposable Syringe without needle, 10cc | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | 14-823-2A | BD Manufacturer Number 309604 |
| Binocular Light Microscope with Seidentopf Head or equivalent | Multiple Vendors | ||
| Blue Rectangular UN-rated Disposal Container, 5G | Berlin Packaging (https://www.berlinpackaging.com/) | 1147T01BLU | Supplemental equipment for chemical waste storage/disposal (Gill hematoxylin and AEC solution) |
| Corning Square and Rectangular Cover Glass, 24×60 | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | 12-553-465 | Corning Manufacturer Number 2975246 |
| Corning Universal Fit Pipet Tips: Racked, Nonsterile (1-200ul) | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | 07-200-300 | Corning Manufacturer Number 4863 |
| Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes, polypropylene | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | 14-959-70C | Corning Manufacturer Number 352097 |
| Falcon 96-Well Assay Plates (Tissue culture plate lids) | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | 08-772-5 | Corning Manufacturer Number 353910 |
| Fisher Brand 25mm Syringe Filter, Nylon, 0.45um, Sterile | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | 09-719D | |
| Fisher Chemical Gill Method Hematoxylin Stain (Gill-2), 4L | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | CS401-1D | |
| Fisherbrand Sharps-A-Gator Point-of-Use Sharps Containers, 5qt | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | 14-827-122 | Supplemental equipment for proper BSL-2 Laboratory Set-Up |
| Fluoro-Gel with Tris Buffer (Gel/Mount Media), 20mL | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 102092-122 | Fluoro-Gel Substitute for BioMeda™ Gel-Mount, Electron Microscopy Sciences |
| Formalin, Buffered, 10%, 4L | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | SF100-4 | Available each or in case of 4 |
| Gilson Pipetman P200 Pipet, 50-200uL | Daigger Scientific (https://www.daigger.com) | EF9930E | |
| Hy-Clone Phosphate Buffered Saline, 1X Solution, 1L (PBS) | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | SH30256LS | Alternative dry powder product can be used |
| Hydrogen Peroxide, 3% | Multiple Vendors | Any commercially available source, such as pharmacy or store brands, etc. | |
| Lens Microscope Objective 20X and 40X | Multiple Vendors | ||
| Lysol IC Quarternary Disinfecting Cleaner, 1G | Daigger Scientific (https://www.daigger.com) | EF8481 | Supplemental materials for proper BSL-2 Laboratory disinfection |
| Miltex brand Disposable Scalpel Size 22 (alternative size to MiniScalpel) | AMD Next (www.amdnext.com) | 999112314 | Supplemental equipment for sample touch impressions; Alternative size to Ag Tek MiniScalpel |
| N,N-Dimethylformamide, Amber Glass Packaging, 500mL | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | D119-500 | |
| Peroxidase Labeled Streptavidin, 50mL | SeraCare (https://www.seracare.com/) | 5550-0001 | KPL Immunoassay and Kits Reference Number 71-00-38 |
| Phosphate Buffered Saline Powder (alternative to Fisher liquid PBS) | Sigma Aldrich (https://www.sigmaaldrich.com/) | P3813 | Must be prepared in 1L distilled water; Available in quantities of 1, 10 and 50 packs |
| Primary antibody: Polyclonal anti-nucleoprotein or cocktail of anti-lyssavirus biotinylated antibodies | Store at 4 degrees C | ||
| PYREX Disposable Serological Pipets, Glass, Sterile, Plugged, Corning, 1.0mL | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 7078D-1 | VWR Manufacturer Number 89091-220 |
| PYREX Disposable Serological Pipets, Glass, Sterile, Plugged, Corning, 10.0mL | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 7078D-10 | VWR Manufacturer Number 89091-106 |
| PYREX Disposable Serological Pipets, Glass, Sterile, Plugged, Corning, 5.0mL | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 7078D-5 | VWR Manufacturer Number 89091-484 |
| Richard-Allan Scientific Gills Hematoxylin Stain No. 2, 1PT (alternative to above) | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | 22-050-201 | Thermo Scientific Manufacturer Number 72504 |
| Slide Holders, 24-place | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 25608-868 | Sakura®Finetek Supplier Number 4465; Available through multiple vendors |
| Specimen Tin Boxes, 1/2oz | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 101412-452 | Supplemental equipment for storage of brain tissue samples |
| Taylor 2-Event Digital Timer/Clock | Multiple Vendors | Supplemental equipment | |
| Tissue-Tek Slide Staining Kit | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 25608-902 | Sakura®Finetek Supplier Number 4551; Available through multiple vendors |
| TWEEN 80, Polyethylene glycol, 500mL | Sigma Aldrich (https://www.sigmaaldrich.com/) | P1754 | Also available in 25mL, 1L and 1G volumes |
| VWR FLIP Pipette Filler (0.05-100mL) | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 53497-055 | |
| VWR Soft Nitrile Examination Gloves, L (100 per box) | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 89038-272 | Supplemental equipment for proper PPE |
| Water, Deionized (20L) | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 10806-022 | |
| Wheaton Clear Glass Sample Vials, 8mL | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | 06-408C | DWK Life Sciences Manufacturer Number 224884 |
| White Coated, Double Well Pattern Microscope Slides, 14mm | Tekdon Incorporated (https://www.tekdon.com/coated-microscope-slides.html) | 2-140 | |
| White Rectangular UN-rate Disposal Container, 5G | Berlin Packaging (https://www.berlinpackaging.com/) | 1147T01WHT | Supplemental equipment for chemical waste storage/disposal (Formalin) |
References
- Dean, D. J., Abelseth, M. K., Atanasiu, P., Meslin, F. X., Kaplan, M. M., Koprowski, H. . Laboratory techniques in rabies. 23, (1996).
- Durr, S., et al. Rabies diagnosis for developing countries. PLOS Neglected Tropical Diseases. 2 (3), e206 (2008).
- Rupprecht, C., et al. . Progress in the development of a direct rapid immunohistochemical test for diagnosing rabies. , (2014).
- Rupprecht, C. E., et al. Additional Progress in the Development and Application of a Direct, Rapid Immunohistochemical Test for Rabies Diagnosis. Journal of Veterinary Science. 5 (2), (2018).
- Coleman, P. G., Fevre, E. M., Cleaveland, S. Estimating the public health impact of rabies. Emerging Infectious Diseases. 10 (1), 140-142 (2004).
- . . Standard Operating Procedure for the Direct Rapid Immunohistochemistry Test (DRIT) for the detection of rabies virus antigens. , (2016).
- Lembo, T., et al. Evaluation of a direct, rapid immunohistochemical test for rabies diagnosis. Emerging Infectious Diseases. 12 (2), 310-313 (2006).
- Middel, K., Fehlner-Gardiner, C., Pulham, N., Buchanan, T. Incorporating Direct Rapid Immunohistochemical Testing into Large-Scale Wildlife Rabies Surveillance. Tropical Medicine and Infectious Disease. 2 (3), 21 (2017).
- Coetzer, A., Sabeta, C. T., Markotter, W., Rupprecht, C. E., Nel, L. H. Comparison of biotinylated monoclonal and polyclonal antibodies in an evaluation of a direct rapid immunohistochemical test for the routine diagnosis of rabies in southern Africa. PLOS Neglected Tropical Diseases. 8 (9), e3189 (2014).
- Kirby, J., et al. Enhanced Rabies Surveillance to Support Effective Oral Rabies Vaccination of Raccoons in the Eastern United States. Tropical Medicine and Infectious Disease. 2 (3), 34 (2017).
- Slate, D., et al. Oral rabies vaccination in north america: opportunities, complexities, and challenges. PLOS Neglected Tropical Diseases. 3 (12), e549 (2009).
- . Direct Rapid Immunohistochemistry Test (DRIT) protocols Available from: https://rabiessurveillanceblueprint.org/Direct-Rapid-Immunohistochemistry?lang=fr (2019)
- Khalid, A., Haque, A. . Touch Impression Cytology Versus Frozen Section as Intraoperative Consultation Diagnosis. 2, (2004).
