מעקב משופר כלבת באמצעות מבחן אימונוהיסטוכימיה ישירה מהירה
Summary
מבחן אימונוהיסטוכימיה מהירה ישירה (DRIT) מציע ארגון עולמי לבריאות בעלי חיים וארגון הבריאות העולמי (OIE/מי) המזוהה נגד נוגדן פלורסנט ישירה (DFA) מבחן לאבחון כלבת. בדיקה זו מאפשרת יישומים מבוססי שדה שניתן לבצע בתוך כ 1 שעות על רשמים במוח באמצעות מיקרוסקופ אור.
Abstract
מעקב מבוסס מעבדה הוא אינטגרלי עבור מניעת כלבת, שליטה וניהול מאמצים. בעוד DFA הוא תקן זהב לאבחון כלבת, יש צורך לאמת טכניקות אבחון נוספות כדי לשפר את מעקב הכלבת, במיוחד במדינות מתפתחות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול סטנדרטי עבור ה-DRIT כאפשרות בדיקה חלופית, מעבדה או מבוססת שדה המשתמשת במיקרוסקופ אור לעומת DFA. טביעות מגע של רקמת המוח שנאספו מבעלי חיים חשודים קבועים ב 10% פורמאלין מאגור. The DRIT משתמש וירוס כלבת-שבטיים ספציפי או נוגדנים שבטיים (מצופנים ל biotin), אנזים streptavidin-peroxidase, וכתבת כרומוגן (כגון מרחריל 3-אמינו -9-ethylcarle) כדי לזהות הכללות ויראליות בתוך הרקמה הנגועה. בתוך 1 h, דגימת רקמות המוח ניתן לבחון ולהתפרש על ידי DRIT. הערכה של מוחות בעלי חיים חשוד נבדק מתוך מגוון רחב של מינים בצפון אמריקה, אסיה, אפריקה, ואירופה מומחשים רגישות גבוהה וספציפיות על ידי DRIT מתקרב 100% עם תוצאות לעומת DFA. מאז 2005, התוכנית של משרד החקלאות של מחלקת שירותי בעלי חיים בארה ב ביצעה בקנה מידה גדול של מאמצים משופרים לכלבת באמצעות ה-DRIT כדי לבחון > דגימות שנאספו מחיות בר בתחומי ניהול אסטרטגי של כלבת . ה-DRIT מספק כלי רב עוצמה וחסכוני לאבחון כלבת, שניתן להשתמש בו על ידי מעבדות וביולוגים שדות כדי לשפר את הפיקוח, תוכניות המניעה והבקרה הנוכחיות של הכלבת.
Introduction
בעוד dfa הוא המבחן הנפוץ ביותר עבור אבחון כלבת שגרתית1, העלות של רכישת ושמירה על מיקרוסקופ פלורסנט יכול להיות מגביל למדינות מתפתחות2,3,4 ועבור רחבה, תוכניות מעקב משופרות בקנה מידה גדול של כלבת3,4. בנוסף, DFA דורש את היכולת להכניס דגימות למקרר במהלך קיבעון לבין הדגימות דגירה מעל טמפרטורת הסביבה במהלך התגובות נוגדנים-אנטיגן, אשר יכול להיות משוכה משמעותית במדינות ללא תשתית מתאימה. בהתאם למגבלות הקשורות לבדיקות DFA מודרניות, ההשפעה הגלובלית של כלבת כבר מזמן לא העריכו את5.
בהקשר זה, יש צורך לאמת טכניקות אבחון נוספות כדי לשפר את מעקב הכלבת ברחבי העולם, בעיקר במדינות מתפתחות. פרוטוקול DRIT המוצג כאן מציע חלופה בדיקה מעבדה או מבוססת על שדה DFA המשתמשת מיקרוסקופ אור אינו דורש קירור או מעבדה דגירה במהלך המבחן6. ה-DRIT ו-DFA דומים בכך ששתי הטכניקות משתמשות בטביעות מגע של דגימות מוח שנאספו מחיות שעשויות להיות בעלי כלבת-נגוע. עם זאת, השלב הראשון של ה-DRIT משתמש בפורמאלין כקיבעון היסטורי לדגימות, המבטלת את נגיף הכלבת. זה מספק שיפור ביולוגי משמעותי על האצטון המשמש כדי לתקן דגימות בפרוטוקול DFA3, אשר חשוב לא רק במעבדה, אבל אולי אפילו יותר בסביבות מעבדה מבוססי שדה או מבוזר. עד היום, drit מראה רגישות וספציפיות שווה dfa2,7,8,9.
מאז 2005, התוכנית של משרד החקלאות האמריקאית ביצעה מאמצים משופרים בתחום הכלבת בצפון אמריקה תוך שימוש ב-DRIT כחלק מתוכנית הניהול המקיפה של כלבת החיות10. מעקב משופר כלבת משמש כהשלמה לחשיפה מבוססת על בריאות הציבור מעקב ובדיקות בעיקר חיות מיני-טורף מינים, כולל דביבונים (לוטור לובל), בואשים פסים (מפיטיס מפיטיס), שועלים אפורים ( שועלים אדומים (וולפסי), וזאביערבות (כלב לאטטרנס) שלא היו מעורבים בחשיפה אנושית או בעלת חיים במשפחה. גוויות בעלי חיים המשמשות בבדיקות הוגשו לשירות משרד החקלאות באמצעות מאמצי מעקב משופרים וכללה מינים וקטוריים של כלבת שאינם: משחק מסוכן או מוזר; נמצא מת, נהרג כביש או מטרד; ואינם משויכים לחשיפה לבעלי חיים אנושיים או ביתיים. DRIT מספק מבחן אבחון כלבת שיכול להיות מועסק על ידי ביולוגים שדה מאומנים עם ניסיון קטן או לא מעבדה כדי לשפר את הפיקוח על הכלבת ולהפחית את הנטל הפיננסי ואת עומס העבודה של מעבדות אבחון בריאות הציבור10. הכשרה DRIT בסיסית עבור עובדי התחום של משרד החקלאות בדרך כלל לוקח 1.5 כדי 2 ימים, אשר כולל כ 4 h של הוראת כיתה כיסוי עקרונות בסיסיים של biosafety טיחות, שיטות איסוף לדוגמה ואת תהליכי DRIT, כמו גם > 8 h של זמן המעבדה מתנהל במבחן. הזדמנויות הכשרה היו זמינים משרד החקלאות ומפעילי התוכנית דרך המרכזים לבקרת מחלות ומניעה (CDC), LYSSA LLC, ואת המכון Wistar.
בתחומי הניהול האסטרטגי, משרד החקלאות הבין בודק למעלה מ-94,000 דגימות חיות הבר באמצעות DRIT וזיהה יותר מ-1,850 דגימות נגוע בכלבת, כי היה סביר להניח שאינם מזוהים להסתמך רק על חשיפה מבוססת בריאות הציבור של חיות חשוד. מעקב משופר של מידע כלבת שסופקו על-ידי תוצאות DRIT הם קריטיים לספק הזמן מלאה יותר וייצוג מרחבי של כלבת על הנוף לתמיכה של תוכניות חיסון אוראלי לכלבת עבור חיות בר ברחבי ארה ב10, . בסדר, 11 באופן דומה, סוכנויות חיות הבר מחוזי בקנדה שילבו DRIT לתוך קנה מידה גדול כלבת חיות מעקב מאמצי בשילוב עם תוכניות בריאות הציבור שלהם עם הצלחה8. הן משרד החקלאות ותוכניות המעקב הקנדי DRIT השתמשו במעבדות התייחסות לאומיות כדי לאשר כלבת על ידי DFA ולבצע משתנה ויראלי הקלדה כראוי8. יתר על כן, ביולוגים משרד החקלאות לשלוח 10% של דגימות שליליות עבור אישור DFA להפנות מעבדות ומאז 2008, השתתפו בדיקות מיומנות DRIT השנתי שסופקו על ידי המעבדה הממלכתית של ויסקונסין היגיינה, כחלק סטנדרטי אמצעי הבטחת איכות.
מטרת שיטה זו היא להציע גישה חלופית לבדיקות אבחון כלבת שניתן לבצע במעבדות מבוזרות, בתחום, או באזורים ללא גישה שגרתית למיקרוסקופיה אלקטרונית.
Protocol
Representative Results
Discussion
DRIT היא שיטה גמישה המתאימה מבוסס שדה מעקב כדי לזהות את הנוכחות של וירוס כלבת כי ניתן להשתמש באזורי מעבדה מבוזרים. אמנם ניתן לבצע את הבדיקה כולה בהגדרה מבוססת שדה כגון על החלל הפנימי של משאית, זה אידיאלי יש מקום קטן, מקורה מוקדש DRIT בשל כימיקלים, ציוד אחסון בעיות האספקה. בנוסף, הקפדה על כל החוקים הפדרליים, המדינה והמקומיים, והתקנות לשימוש כימי ולסילוק החומרים חייבים להיחשב. כיום, משרד החקלאות האמריקנית מציע 15 מתקני DRIT כדי לבדוק דגימות מ -17 מדינות. מתקני משרד החקלאות הלאומית drit הוקמו בשיתוף עם האוניברסיטה ומעבדות בריאות הציבור המדיני, בחדרים מיועדים בתוך מתקנים גדולים ובטריילרים סגורים כי כבר הפכו והומרו לשמש יחידות בדיקה ניידות ב אירוע של תגובת התפרצות חירום שבה בדיקה משופרת של מעקב אחר כלבת עם זמן הטיפול המיידי הוא קריטי (איור 5).
בעוד הבדיקה הצליחה באמצעות חומר בדיקת גזע של איכות משתנה, רקמת המוח טרי ללא התפרקות רקמות הוא אופטימלי. כמו ריקבון, התייבשות, או ניזול מתרחשת, איכות לדוגמה פוחתת הבדיקה עשויה לגלות מכתים יותר לא ספציפי אשר יכול לבלבל את התוצאות. התבוננות זו דומה בין DFA לבין DRIT2. יש לאסוף את המוח במהירות האפשרית ולאחר מכן לאחסנם מוקפאים (-20 ° c) עד לבדיקה.
בדרך כלל, רוב מתקני משרד החקלאות מ 12 עד 24 שקופיות בבת אחת במהלך הפעלת DRIT, כולל אחד שליטה חיובית ושליטה אחת שלילית כי אושרו באמצעות DFA. פקדים חיוביים ושליליים מספקים נקודת התייחסות לכל הפעלה של DRIT כדי לוודא שהבדיקה הצליחה ולאשר אם השאלות המפרטיביות עולות על שקופיות הבדיקה. אם מדגם לא נקבע כתוצאה חיובית ברורה או שלילית, הוא מתויג כקבוע ונבדק פעם שנייה על-ידי DRIT. אם דוגמה זו אינה חיובית ברורה או שלילית לאחר שני בדיקות DRIT, הוא נשלח למעבדת התייחסות DFA או בדיקות קשורות.
כמו בכל מבחן אבחון, ‘ צרות ירי ‘ הוא שימושי עם ממצאים בלתי צפויים. לדוגמה, אם הפעלת DRIT אינה מצליחה (כלומר, הפקד החיובי אינו מוצג +3 או + 4 כתמים והפצת אנטיגן), ודאו שכל הכימיקלים והחומרים הכימיים לא פגו. מצאנו באמצעות בקבוק חדש שנפתח של תחמוצת מימן במינימום של פעם בשבוע הוא שימושי כדי לסייע למנוע מכתים לא ספציפיים דרך חמצון של רקמת המוח. בנוסף, אנו ממליצים להחליף מאגר אצטט לפחות פעם אחת בכל שנה לכל הפחות, ללא קשר לתאריך התפוגה של התווית.
ישנם מספר יתרונות של DRIT על DFA כולל עלויות נמוכות יותר, היכולת לבצע את הבדיקה מחוץ למעבדה מרכזית, צורך רק מיקרוסקופ אור במקום מיקרוסקופ פלורסנט, ואת תהליך האימונים פשוט יחסית עבור אנשים מנהל וקורא. את המבחן2,3,4 יתרונות אלה, ביחד עם רגישות וספציפיות של drit הדומות dfa2,7,8,9 כבר הוכיחו כי הבדיקה משמש כלי חשוב בקנה מידה רחב תוכניות מעקב משופרות כלבת8,10 בצפון אמריקה. בנוסף, DRIT יש פוטנציאל לאפשר מעקב מוגבר ובדיקות יותר בקשה במדינות מתפתחות או אזורים אחרים עם משאבים מוגבלים, במיוחד לאחר OIE האחרונות/מי הדרכה כמבחן מומלץ.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מכירים את כל אנשי משרד החקלאות שירותי חיות הבר שאספו בעבר דגימות מעקב משופרות כלבת וניהלו את ה-DRIT לאבחון כלבת. כמו כן, אנו מכירים את הפעילים הרבים העוזרים לנו באוסף מעקב משופר עם כלבת. אנו מודים גם למרכזים לבקרת מחלות ומניעתן ולמכון וויסטאר לגישה לריאגנטים קריטי הנדרש לבצע את ה-DRIT ולספק הזדמנויות הכשרה. בנוסף, אנו מעריכים את האבחון הconfirmatory והסיוע הטכני המסופקים על-ידי המרכז לבקרת מחלות ומניעתן ועל ידי מרכז וודסוורת ‘ עם משרד הבריאות של מדינת ניו יורק. השימוש במוצרים מסחריים מיועד למטרות השוואה בלבד ואינו מהווה תמיכה.
Materials
| 3-Amino-9-Ethylcarbazole (AEC tablets; 50 count) | Sigma Aldrich (https://www.sigmaaldrich.com/) | A6926 | |
| Acetate Buffer, 0.1M, 5.2 pH, 32oz | Poly Scientific R&D Corp. (https://www.polyrnd.com/) | s140 | |
| Ag Tek MiniScalpel, PN110, Non-sterile #10, 40 per package | Patterson Veterinary (https://www.pattersonvet.com/) | PN110 | Supplemental equipment for sample touch impressions; Also available through Clipper Distributing (http://www.clipperdist.net/) |
| BD Luer-Lok Disposable Syringe without needle, 10cc | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | 14-823-2A | BD Manufacturer Number 309604 |
| Binocular Light Microscope with Seidentopf Head or equivalent | Multiple Vendors | ||
| Blue Rectangular UN-rated Disposal Container, 5G | Berlin Packaging (https://www.berlinpackaging.com/) | 1147T01BLU | Supplemental equipment for chemical waste storage/disposal (Gill hematoxylin and AEC solution) |
| Corning Square and Rectangular Cover Glass, 24×60 | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | 12-553-465 | Corning Manufacturer Number 2975246 |
| Corning Universal Fit Pipet Tips: Racked, Nonsterile (1-200ul) | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | 07-200-300 | Corning Manufacturer Number 4863 |
| Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes, polypropylene | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | 14-959-70C | Corning Manufacturer Number 352097 |
| Falcon 96-Well Assay Plates (Tissue culture plate lids) | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | 08-772-5 | Corning Manufacturer Number 353910 |
| Fisher Brand 25mm Syringe Filter, Nylon, 0.45um, Sterile | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | 09-719D | |
| Fisher Chemical Gill Method Hematoxylin Stain (Gill-2), 4L | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | CS401-1D | |
| Fisherbrand Sharps-A-Gator Point-of-Use Sharps Containers, 5qt | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | 14-827-122 | Supplemental equipment for proper BSL-2 Laboratory Set-Up |
| Fluoro-Gel with Tris Buffer (Gel/Mount Media), 20mL | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 102092-122 | Fluoro-Gel Substitute for BioMeda™ Gel-Mount, Electron Microscopy Sciences |
| Formalin, Buffered, 10%, 4L | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | SF100-4 | Available each or in case of 4 |
| Gilson Pipetman P200 Pipet, 50-200uL | Daigger Scientific (https://www.daigger.com) | EF9930E | |
| Hy-Clone Phosphate Buffered Saline, 1X Solution, 1L (PBS) | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | SH30256LS | Alternative dry powder product can be used |
| Hydrogen Peroxide, 3% | Multiple Vendors | Any commercially available source, such as pharmacy or store brands, etc. | |
| Lens Microscope Objective 20X and 40X | Multiple Vendors | ||
| Lysol IC Quarternary Disinfecting Cleaner, 1G | Daigger Scientific (https://www.daigger.com) | EF8481 | Supplemental materials for proper BSL-2 Laboratory disinfection |
| Miltex brand Disposable Scalpel Size 22 (alternative size to MiniScalpel) | AMD Next (www.amdnext.com) | 999112314 | Supplemental equipment for sample touch impressions; Alternative size to Ag Tek MiniScalpel |
| N,N-Dimethylformamide, Amber Glass Packaging, 500mL | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | D119-500 | |
| Peroxidase Labeled Streptavidin, 50mL | SeraCare (https://www.seracare.com/) | 5550-0001 | KPL Immunoassay and Kits Reference Number 71-00-38 |
| Phosphate Buffered Saline Powder (alternative to Fisher liquid PBS) | Sigma Aldrich (https://www.sigmaaldrich.com/) | P3813 | Must be prepared in 1L distilled water; Available in quantities of 1, 10 and 50 packs |
| Primary antibody: Polyclonal anti-nucleoprotein or cocktail of anti-lyssavirus biotinylated antibodies | Store at 4 degrees C | ||
| PYREX Disposable Serological Pipets, Glass, Sterile, Plugged, Corning, 1.0mL | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 7078D-1 | VWR Manufacturer Number 89091-220 |
| PYREX Disposable Serological Pipets, Glass, Sterile, Plugged, Corning, 10.0mL | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 7078D-10 | VWR Manufacturer Number 89091-106 |
| PYREX Disposable Serological Pipets, Glass, Sterile, Plugged, Corning, 5.0mL | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 7078D-5 | VWR Manufacturer Number 89091-484 |
| Richard-Allan Scientific Gills Hematoxylin Stain No. 2, 1PT (alternative to above) | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | 22-050-201 | Thermo Scientific Manufacturer Number 72504 |
| Slide Holders, 24-place | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 25608-868 | Sakura®Finetek Supplier Number 4465; Available through multiple vendors |
| Specimen Tin Boxes, 1/2oz | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 101412-452 | Supplemental equipment for storage of brain tissue samples |
| Taylor 2-Event Digital Timer/Clock | Multiple Vendors | Supplemental equipment | |
| Tissue-Tek Slide Staining Kit | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 25608-902 | Sakura®Finetek Supplier Number 4551; Available through multiple vendors |
| TWEEN 80, Polyethylene glycol, 500mL | Sigma Aldrich (https://www.sigmaaldrich.com/) | P1754 | Also available in 25mL, 1L and 1G volumes |
| VWR FLIP Pipette Filler (0.05-100mL) | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 53497-055 | |
| VWR Soft Nitrile Examination Gloves, L (100 per box) | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 89038-272 | Supplemental equipment for proper PPE |
| Water, Deionized (20L) | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 10806-022 | |
| Wheaton Clear Glass Sample Vials, 8mL | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | 06-408C | DWK Life Sciences Manufacturer Number 224884 |
| White Coated, Double Well Pattern Microscope Slides, 14mm | Tekdon Incorporated (https://www.tekdon.com/coated-microscope-slides.html) | 2-140 | |
| White Rectangular UN-rate Disposal Container, 5G | Berlin Packaging (https://www.berlinpackaging.com/) | 1147T01WHT | Supplemental equipment for chemical waste storage/disposal (Formalin) |
References
- Dean, D. J., Abelseth, M. K., Atanasiu, P., Meslin, F. X., Kaplan, M. M., Koprowski, H. . Laboratory techniques in rabies. 23, (1996).
- Durr, S., et al. Rabies diagnosis for developing countries. PLOS Neglected Tropical Diseases. 2 (3), e206 (2008).
- Rupprecht, C., et al. . Progress in the development of a direct rapid immunohistochemical test for diagnosing rabies. , (2014).
- Rupprecht, C. E., et al. Additional Progress in the Development and Application of a Direct, Rapid Immunohistochemical Test for Rabies Diagnosis. Journal of Veterinary Science. 5 (2), (2018).
- Coleman, P. G., Fevre, E. M., Cleaveland, S. Estimating the public health impact of rabies. Emerging Infectious Diseases. 10 (1), 140-142 (2004).
- . . Standard Operating Procedure for the Direct Rapid Immunohistochemistry Test (DRIT) for the detection of rabies virus antigens. , (2016).
- Lembo, T., et al. Evaluation of a direct, rapid immunohistochemical test for rabies diagnosis. Emerging Infectious Diseases. 12 (2), 310-313 (2006).
- Middel, K., Fehlner-Gardiner, C., Pulham, N., Buchanan, T. Incorporating Direct Rapid Immunohistochemical Testing into Large-Scale Wildlife Rabies Surveillance. Tropical Medicine and Infectious Disease. 2 (3), 21 (2017).
- Coetzer, A., Sabeta, C. T., Markotter, W., Rupprecht, C. E., Nel, L. H. Comparison of biotinylated monoclonal and polyclonal antibodies in an evaluation of a direct rapid immunohistochemical test for the routine diagnosis of rabies in southern Africa. PLOS Neglected Tropical Diseases. 8 (9), e3189 (2014).
- Kirby, J., et al. Enhanced Rabies Surveillance to Support Effective Oral Rabies Vaccination of Raccoons in the Eastern United States. Tropical Medicine and Infectious Disease. 2 (3), 34 (2017).
- Slate, D., et al. Oral rabies vaccination in north america: opportunities, complexities, and challenges. PLOS Neglected Tropical Diseases. 3 (12), e549 (2009).
- . Direct Rapid Immunohistochemistry Test (DRIT) protocols Available from: https://rabiessurveillanceblueprint.org/Direct-Rapid-Immunohistochemistry?lang=fr (2019)
- Khalid, A., Haque, A. . Touch Impression Cytology Versus Frozen Section as Intraoperative Consultation Diagnosis. 2, (2004).
