Surveillance accrue de la rage à l'aide d'un test immunohistochimique rapide direct
Summary
Le test immunohistochimique rapide direct (DRIT) offre une alternative reconnue par l’Organisation mondiale de la santé animale et de l’Organisation mondiale de la santé (OIE/OMS) au test direct d’anticorps fluorescents (DFA) pour le diagnostic de la rage. Ce test permet des applications sur le terrain qui peuvent être effectuées en environ 1 h sur les impressions cérébrales à l’aide de la microscopie légère.
Abstract
La surveillance en laboratoire fait partie intégrante des efforts de prévention, de contrôle et de gestion de la rage. Bien que le MAE soit l’étalon-or du diagnostic de la rage, il est nécessaire de valider d’autres techniques de diagnostic pour améliorer la surveillance de la rage, en particulier dans les pays en développement. Ici, nous présentons un protocole standard pour le DRIT comme une option alternative, en laboratoire ou sur le terrain d’essai qui utilise la microscopie légère par rapport au DFAE. Les impressions tactiles de tissu cérébral prélevées sur des animaux suspects sont fixées dans une formaline tamponnée de 10 %. Le DRIT utilise des anticorps monoclonaux ou polyclonales spécifiques au virus de la rage (conjugués à la biotine), une enzyme streptavidin-peroxidase et un journaliste chromogène (comme l’acétyl 3-amino-9-éthylcarbazole) pour détecter les inclusions virales dans les tissus infectés. Dans environ 1 h, un échantillon de tissu cérébral peut être testé et interprété par le DRIT. L’évaluation des cerveaux animaux suspects testés à partir d’une variété d’espèces en Amérique du Nord, en Asie, en Afrique et en Europe a montré une sensibilité et une spécificité élevées par le DRIT approchant 100% avec les résultats par rapport au DFAE. Depuis 2005, le programme Wildlife Services (USDA WS) du département de l’Agriculture des États-Unis a mené des efforts de surveillance de la rage à grande échelle en utilisant le DRIT pour tester 94 000 échantillons prélevés sur la faune dans des zones stratégiques de gestion de la rage. . Le DRIT fournit un outil puissant et économique pour le diagnostic de la rage qui peut être utilisé par les travailleurs et les biologistes de terrain pour améliorer les programmes actuels de surveillance, de prévention et de contrôle de la rage à l’échelle mondiale.
Introduction
Bien que le DFAE soit le test le plus utilisé pour le diagnostic systématique de la rage1, le coût d’achat et d’entretien d’un microscope fluorescent peut être limité aux pays en développement2,3,4 et pour les larges, programmes améliorés de surveillance de la rage à grande échelle3,4. En outre, le DFA exige la possibilité de réfrigérer des échantillons pendant la fixation et d’incuber des échantillons au-dessus de la température ambiante pendant les réactions anticorps-antigènes, ce qui peut constituer un obstacle important dans les pays sans infrastructure appropriée. En partie en raison des limites associées aux tests modernes du DFAE, l’impact mondial de la rage a longtemps été sous-estimé5.
À cet égard, il est nécessaire de valider d’autres techniques de diagnostic pour améliorer la surveillance de la rage à l’échelle mondiale, en particulier dans les pays en développement. Le protocole DRIT présenté ici offre une alternative d’essai en laboratoire ou sur le terrain au DFAE qui utilise la microscopie légère et ne nécessite pas de réfrigération ou d’incubation en laboratoire pendant le test6. Le DRIT et le DFAE sont similaires en ce que les deux techniques utilisent des impressions tactiles d’échantillons de cerveau prélevés sur des animaux potentiellement enragés. Cependant, la première étape de la DRIT utilise la formaline comme un fixatif historique pour les échantillons, qui inactive le virus de la rage. Cela fournit une amélioration substantielle de la biosécurité par rapport à l’acétone utilisée pour fixer des échantillons dans le protocole3du DFAE, ce qui est important non seulement en laboratoire, mais peut-être encore plus dans les environnements de laboratoire sur le terrain ou décentralisés. À ce jour, le DRIT fait preuved’une sensibilité et d’une spécificité égales au DFA 2,7,8,9.
Depuis 2005, le programme WS de l’USDA a mené des efforts de surveillance de la rage à grande échelle en Amérique du Nord en utilisant le DRIT dans le cadre d’un programme complet de gestion de la rage de la faune10. La surveillance accrue de la rage est utilisée comme complément à la surveillance de la santé publique basée sur l’exposition et aux tests principalement des espèces méso-carnivores de la faune, y compris les ratons laveurs (Procyon lotor), les mouffettes rayées (Mephitis mephitis), les renards gris ( Urocyon cinereoargenteus), renards roux (Vulpes vulpes) et coyotes (Canis latrans) qui n’ont pas été impliqués dans une exposition humaine ou domestique. Les carcasses d’animaux utilisées dans les essais ont été soumises à l’USDA WS grâce à des efforts accrus de surveillance de la rage et comprenaient des espèces vecteurs de la rage qui sont : des acteurs malades ou étranges; trouvé mort, tué sur la route, ou une nuisance; et ne sont pas associés à une exposition humaine ou domestique. Le DRIT fournit un test de diagnostic de la rage qui peut être utilisé par des biologistes de terrain formés avec peu ou pas d’expérience de laboratoire pour améliorer la surveillance de la rage et de réduire le fardeau financier et la charge de travail des laboratoires de diagnostic de santé publique10. La formation de base DRIT pour les employés de terrain USDA WS prend généralement 1,5 à 2 jours, ce qui comprend environ 4 h d’enseignement en classe couvrant les principes fondamentaux de la biosécurité, les méthodes de collecte d’échantillons et les processus DRIT ainsi que ‘gt;8 h de temps de laboratoire pour effectuer l’essai. Des possibilités de formation ont été offertes aux usDA WS et aux coopérateurs de programmes par l’intermédiaire des Centers for Disease Control and Prevention (CDC), de LYSSA LLC et du Wistar Institute.
Dans les zones de gestion stratégique, USDA WS a testé plus de 94 000 échantillons d’animaux sauvages à l’aide du DRIT et a détecté plus de 1 850 échantillons enragés qui n’auraient probablement pas été détectés en se fondant uniquement sur des tests de santé publique fondés sur l’exposition d’animaux suspects. L’amélioration des données de surveillance de la rage fournies par les résultats de la DRIT est essentielle pour fournir une représentation temporelle et spatiale plus complète de la rage dans le paysage à l’appui des programmes de vaccination antirabique orale pour la faune dans l’ensemble des États-Unis10, 11. De même, les organismes provinciaux de protection de la faune du Canada ont intégré le DRIT dans les efforts de surveillance de la rage de la faune à grande échelle en tandem avec leurs programmes de santé publique avec succès8. Les programmes canadiens de surveillance de l’USDA WS et de la DRIT canadienne ont utilisé des laboratoires de référence nationaux pour confirmer la rage par le DFAE et pour effectuer la dactylographie virale au besoin8. En outre, les biologistes de terrain de l’USDA WS envoient 10 % des échantillons négatifs pour la confirmation du DFAE aux laboratoires de référence et, depuis 2008, ont participé à des tests de compétence DRIT semestriels fournis par le Wisconsin State Laboratory of Hygiene, dans le cadre de la norme mesures d’assurance de la qualité.
L’objectif de cette méthode est d’offrir une approche alternative pour les tests de diagnostic de la rage qui peut être fait dans des laboratoires décentralisés, sur le terrain ou dans des zones sans accès systématique à la microscopie électronique.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le DRIT est une méthode flexible adaptée à la surveillance sur le terrain pour détecter la présence du virus de la rage qui peut être utilisé dans les zones de laboratoire décentralisées. Bien qu’il soit possible d’effectuer l’ensemble de l’essai dans un cadre sur le terrain comme sur le hayon d’un camion, il est idéal d’avoir un petit espace intérieur dédié à DRIT en raison de problèmes chimiques, d’équipement et de stockage d’approvisionnement. En outre, le respect de toutes les lois fédérales, étatiques et locales applicables, ainsi que les règlements d’utilisation et d’élimination des produits chimiques doivent être pris en considération. Actuellement, USDA WS dispose de 15 installations DRIT pour tester des échantillons provenant de 17 États. Les installations DE l’USDA WS DRIT sont établies en collaboration avec les laboratoires de santé publique des universités et de l’État, dans des salles désignées dans des installations plus grandes et dans des remorques fermées qui ont été réaménagées et converties pour servir d’unités d’essai mobiles dans le cas d’intervention d’urgence en cas d’éclosion d’urgence où il est essentiel d’améliorer les tests de surveillance de la rage avec un délai d’exécution immédiat (figure 5).
Tandis que le essai a été réussi utilisant le matériel de tronc cérébral de qualité variable, le tissu frais de tronc cérébral sans décomposition de tissu est optimal. À mesure que la décomposition, la dessiccation ou la liquéfaction se produit, la qualité de l’échantillon diminue et le test peut détecter des taches plus non spécifiques qui peuvent confondre les résultats. Cette observation est similaire entre le DFAE et le DRIT2. Le tronc cérébral/SNC doit être recueilli dès que possible, puis conservé congelé (-20 oC) jusqu’à l’essai.
En règle générale, la plupart des installations WS de l’USDA traitent de 12 à 24 diapositives à la fois au cours d’une session DRIT, y compris un contrôle positif et un contrôle négatif qui ont été confirmés par l’intermédiaire du MAE. Les contrôles positifs et négatifs fournissent un point de référence pour chaque course DRIT pour s’assurer que le test a été réussi et pour confirmer si des questions d’interprétation se posent sur les diapositives de test. Si un échantillon n’est pas déterminé comme présentant un résultat positif ou négatif clair, il est étiqueté comme indéterminé et testé une deuxième fois par drIT. Si cet échantillon n’est pas clairement positif ou négatif après deux tests DRIT, il est envoyé à un laboratoire de référence pour le DFA ECaf ou les tests connexes.
Comme pour tout test de diagnostic, le « tir à la difficulté » est utile avec des résultats inattendus. Par exemple, si une course DRIT est infructueuse (c.-à-d. que le contrôle positif ne présente pas d’intensité de coloration et de distribution d’antigènes de 3 ou 4), assurez-vous que tous les produits chimiques et réactifs n’ont pas expiré. Nous avons trouvé l’utilisation d’une bouteille nouvellement ouverte de peroxyde d’hydrogène au moins une fois par semaine est utile pour aider à prévenir la coloration non spécifique par l’oxydation du tissu cérébral. En outre, nous recommandons de remplacer le tampon d’acétate au moins une fois par an au minimum, quelle que soit la date d’expiration étiquetée.
Il y a un certain nombre d’avantages de la DRIT par rapport au DFAE, y compris des coûts plus bas, la capacité d’effectuer le test à l’extérieur d’un laboratoire centralisé, le besoin de microscopie légère au lieu d’un microscope fluorescent, et le processus de formation relativement simple pour personnes administrant et lisant le test2,3,4. Ces avantages, couplés à la sensibilité et la spécificité de la DRIT qui sont comparables à DFA2,7,8,9 ont déjà prouvé que le test sert d’outil important à grande échelle programmes améliorés de surveillance de la rage8,10 en Amérique du Nord. En outre, le DRIT pourrait permettre une surveillance accrue et des tests plus rapides dans les pays en développement ou dans d’autres régions où les ressources sont limitées, en particulier après les récentes directives de l’OIE et de l’OMS en tant que test recommandé.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous rendons hommage à tout le personnel des Services de la faune de l’USDA qui, à l’heure actuelle ou en a déjà recueilli, a recueilli des échantillons améliorés de surveillance de la rage et qui a effectué le DRIT pour le diagnostic de la rage. De même, nous reconnaissons les nombreux coopérateurs qui nous aident dans la collecte améliorée de la surveillance de la rage. Nous remercions également les Centers for Disease Control and Prevention et l’Institut Wistar pour l’accès à des réactifs essentiels nécessaires à la conduite du DRIT et pour offrir des possibilités de formation. En outre, nous apprécions le diagnostic de confirmation et l’assistance technique fournie par les Centers for Disease Control and Prevention et par le Wadsworth Center avec le Département de la Santé de l’État de New York. L’utilisation de tout produit commercial n’est qu’à des fins de comparaison et ne constitue pas une approbation.
Materials
| 3-Amino-9-Ethylcarbazole (AEC tablets; 50 count) | Sigma Aldrich (https://www.sigmaaldrich.com/) | A6926 | |
| Acetate Buffer, 0.1M, 5.2 pH, 32oz | Poly Scientific R&D Corp. (https://www.polyrnd.com/) | s140 | |
| Ag Tek MiniScalpel, PN110, Non-sterile #10, 40 per package | Patterson Veterinary (https://www.pattersonvet.com/) | PN110 | Supplemental equipment for sample touch impressions; Also available through Clipper Distributing (http://www.clipperdist.net/) |
| BD Luer-Lok Disposable Syringe without needle, 10cc | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | 14-823-2A | BD Manufacturer Number 309604 |
| Binocular Light Microscope with Seidentopf Head or equivalent | Multiple Vendors | ||
| Blue Rectangular UN-rated Disposal Container, 5G | Berlin Packaging (https://www.berlinpackaging.com/) | 1147T01BLU | Supplemental equipment for chemical waste storage/disposal (Gill hematoxylin and AEC solution) |
| Corning Square and Rectangular Cover Glass, 24×60 | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | 12-553-465 | Corning Manufacturer Number 2975246 |
| Corning Universal Fit Pipet Tips: Racked, Nonsterile (1-200ul) | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | 07-200-300 | Corning Manufacturer Number 4863 |
| Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes, polypropylene | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | 14-959-70C | Corning Manufacturer Number 352097 |
| Falcon 96-Well Assay Plates (Tissue culture plate lids) | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | 08-772-5 | Corning Manufacturer Number 353910 |
| Fisher Brand 25mm Syringe Filter, Nylon, 0.45um, Sterile | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | 09-719D | |
| Fisher Chemical Gill Method Hematoxylin Stain (Gill-2), 4L | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | CS401-1D | |
| Fisherbrand Sharps-A-Gator Point-of-Use Sharps Containers, 5qt | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | 14-827-122 | Supplemental equipment for proper BSL-2 Laboratory Set-Up |
| Fluoro-Gel with Tris Buffer (Gel/Mount Media), 20mL | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 102092-122 | Fluoro-Gel Substitute for BioMeda™ Gel-Mount, Electron Microscopy Sciences |
| Formalin, Buffered, 10%, 4L | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | SF100-4 | Available each or in case of 4 |
| Gilson Pipetman P200 Pipet, 50-200uL | Daigger Scientific (https://www.daigger.com) | EF9930E | |
| Hy-Clone Phosphate Buffered Saline, 1X Solution, 1L (PBS) | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | SH30256LS | Alternative dry powder product can be used |
| Hydrogen Peroxide, 3% | Multiple Vendors | Any commercially available source, such as pharmacy or store brands, etc. | |
| Lens Microscope Objective 20X and 40X | Multiple Vendors | ||
| Lysol IC Quarternary Disinfecting Cleaner, 1G | Daigger Scientific (https://www.daigger.com) | EF8481 | Supplemental materials for proper BSL-2 Laboratory disinfection |
| Miltex brand Disposable Scalpel Size 22 (alternative size to MiniScalpel) | AMD Next (www.amdnext.com) | 999112314 | Supplemental equipment for sample touch impressions; Alternative size to Ag Tek MiniScalpel |
| N,N-Dimethylformamide, Amber Glass Packaging, 500mL | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | D119-500 | |
| Peroxidase Labeled Streptavidin, 50mL | SeraCare (https://www.seracare.com/) | 5550-0001 | KPL Immunoassay and Kits Reference Number 71-00-38 |
| Phosphate Buffered Saline Powder (alternative to Fisher liquid PBS) | Sigma Aldrich (https://www.sigmaaldrich.com/) | P3813 | Must be prepared in 1L distilled water; Available in quantities of 1, 10 and 50 packs |
| Primary antibody: Polyclonal anti-nucleoprotein or cocktail of anti-lyssavirus biotinylated antibodies | Store at 4 degrees C | ||
| PYREX Disposable Serological Pipets, Glass, Sterile, Plugged, Corning, 1.0mL | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 7078D-1 | VWR Manufacturer Number 89091-220 |
| PYREX Disposable Serological Pipets, Glass, Sterile, Plugged, Corning, 10.0mL | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 7078D-10 | VWR Manufacturer Number 89091-106 |
| PYREX Disposable Serological Pipets, Glass, Sterile, Plugged, Corning, 5.0mL | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 7078D-5 | VWR Manufacturer Number 89091-484 |
| Richard-Allan Scientific Gills Hematoxylin Stain No. 2, 1PT (alternative to above) | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | 22-050-201 | Thermo Scientific Manufacturer Number 72504 |
| Slide Holders, 24-place | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 25608-868 | Sakura®Finetek Supplier Number 4465; Available through multiple vendors |
| Specimen Tin Boxes, 1/2oz | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 101412-452 | Supplemental equipment for storage of brain tissue samples |
| Taylor 2-Event Digital Timer/Clock | Multiple Vendors | Supplemental equipment | |
| Tissue-Tek Slide Staining Kit | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 25608-902 | Sakura®Finetek Supplier Number 4551; Available through multiple vendors |
| TWEEN 80, Polyethylene glycol, 500mL | Sigma Aldrich (https://www.sigmaaldrich.com/) | P1754 | Also available in 25mL, 1L and 1G volumes |
| VWR FLIP Pipette Filler (0.05-100mL) | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 53497-055 | |
| VWR Soft Nitrile Examination Gloves, L (100 per box) | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 89038-272 | Supplemental equipment for proper PPE |
| Water, Deionized (20L) | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 10806-022 | |
| Wheaton Clear Glass Sample Vials, 8mL | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | 06-408C | DWK Life Sciences Manufacturer Number 224884 |
| White Coated, Double Well Pattern Microscope Slides, 14mm | Tekdon Incorporated (https://www.tekdon.com/coated-microscope-slides.html) | 2-140 | |
| White Rectangular UN-rate Disposal Container, 5G | Berlin Packaging (https://www.berlinpackaging.com/) | 1147T01WHT | Supplemental equipment for chemical waste storage/disposal (Formalin) |
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