Улучшенное наблюдение за бешенством с помощью прямого быстрого иммуногистохимического теста
Summary
Прямой экспресс-иммуногистохимический тест (DRIT) предлагает Всемирную организацию по охране здоровья животных и Всемирную организацию здравоохранения (OIE/WHO) признанной альтернативой прямому флуоресцентным антителам (DFA) для диагностики бешенства. Этот тест позволяет для полевых приложений, которые могут быть выполнены примерно в 1 ч на мозг впечатления с помощью световой микроскопии.
Abstract
Лабораторное наблюдение является неотъемлемой частью усилий по профилактике бешенства, борьбе с ним и борьбе с ним. Хотя DFA является золотым стандартом для диагностики бешенства, существует необходимость в проверке дополнительных диагностических методов для улучшения эпиднадзора за бешенством, особенно в развивающихся странах. Здесь мы представляем стандартный протокол для DRIT в качестве альтернативного, лабораторного или полевого тестирования вариант, который использует световую микроскопию по сравнению с DFA. Сенсорные впечатления от мозговой ткани, собранные у подозрительных животных, фиксируются в 10% буферизированном формалине. DRIT использует вирус бешенства конкретных моноклональных или поликлональных антител (конъюгированных биотин), стрептавидин-пероксидаза фермента, и хромоген репортер (например, ацетил 3-амино-9-этилкарбазол) для обнаружения вирусных включений в инфицированных тканях. Примерно в 1 ч образец ткани мозга может быть проверен и интерпретирован DRIT. Оценка мозга подозреваемых животных, протестированных у различных видов в Северной Америке, Азии, Африке и Европе, проиллюстрировала высокую чувствительность и специфичность DRIT, приближающегося к 100% с результатами по сравнению с DFA. С 2005 года, Министерство сельского хозяйства США службы дикой природы (USDA WS) программа провела крупномасштабные расширенные усилия по эпиднадзору за бешенством с использованием DRIT для тестирования . DRIT обеспечивает мощный, экономичный инструмент для диагностики бешенства, который может быть использован лабораториями и полевыми биологами для улучшения текущих программ эпиднадзора за бешенством, профилактики и борьбы с ним во всем мире.
Introduction
В то время как DFA является наиболее широко используемым тестом для рутинной диагностики бешенства1, стоимость покупки и поддержания флуоресцентного микроскопа может быть ограничена развивающихся стран2,3,4 и для широкого, крупномасштабных расширенных программ эпиднадзора за бешенством3,4. Кроме того, DFA требует способности хранить образцы во время фиксации и инкубировать образцы выше температуры окружающей среды во время антител-антигенных реакций, которые могут быть значительным препятствием в странах, не имеющих подходящей инфраструктуры. Отчасти из-за ограничений, связанных с современным тестированием DFA, глобальное воздействие бешенства уже давно недооценено5.
В этой связи необходимо утвердить дополнительные диагностические методы для улучшения эпиднадзора за бешенством во всем мире, особенно в развивающихся странах. Представленный здесь протокол DRIT предлагает лабораторную или полевую альтернативу тестированию DFA, которая использует световуюмикроскопию и не требует охлаждения или лабораторной инкубации во время испытания 6. DRIT и DFA похожи в том, что оба метода используют сенсорные впечатления образцов мозга, собранных у потенциально бешеных животных. Тем не менее, первый шаг DRIT использует формалин в качестве исторического фиксатора для образцов, который инактивирует вирус бешенства. Это обеспечивает существенное улучшение биобезопасности по сравнению с ацетоном, используемым для фиксации образцов в протоколе DFA3, что важно не только в лаборатории, но, возможно, даже в большей степени в полевых или децентрализованных лабораторных средах. На сегодняшний день DRIT показывает чувствительность и специфичность, равную DFA2,7,8,9.
С 2005 года программа USDA WS проводит крупномасштабные расширенные усилия по эпиднадзору за бешенством в Северной Америке с использованием DRIT в рамках комплексной программы по борьбе с бешенством в дикой природе10. Усиленный эпиднадзор за бешенством используется в качестве дополнения к наблюдению за общественным здравоохранением на основе воздействия и тесты в первую очередь дикой природы мезо-плотоядных видов, в том числе енотов (Procyon lotor), полосатые скунсы (Мефит мефит), серые лисы ( Urocyon cinereoargenteus), красные лисы (Vulpes vulpes), и койоты (Canis latrans), которые не были вовлечены в воздействие на человека или домашних животных. Туши животных, используемые в тестировании, были представлены USDA WS путем усиления усилий по эпиднадзору за бешенством и включали в себя виды переносчиков бешенства, которые являются: больными или странными действиями; найден мертвым, дорожно-убит, или неприятность; и не связаны с воздействием животных на человека или в домашних животных. DRIT обеспечивает диагностику бешенства, которые могут быть использованы квалифицированных полевых биологов с небольшим или вообще без лабораторного опыта для улучшения эпиднадзора за бешенством и снижения финансовой нагрузки и рабочей нагрузки общественного здравоохранения диагностических лабораторий10. Базовая подготовка DRIT для сотрудников USDA WS, как правило, занимает от 1,5 до 2 дней, что включает в себя примерно 4 ч классной инструкции, охватывающей основные принципы биобезопасности, методы сбора образцов и процессы DRIT, а также лабораторное время проведения теста. Возможности обучения были доступны USDA WS и кооператоров программы через Центры по контролю и профилактике заболеваний (CDC), LYSSA LLC, и Wistar институт.
В стратегических областях управления, USDA WS протестировалболеее более 94000 образцов дикой природы с использованием DRIT и обнаружил более 1850 бешеных образцов, которые, вероятно, остались незамеченными, полагаясь только на воздействие на основе общественного тестирования здоровья подозрительных животных. Расширенные данные эпиднадзора за бешенством, представленные результатами DRIT, имеют решающее значение для обеспечения более полного временного и пространственного представления бешенства на ландшафте в поддержку пероральных программ вакцинации против бешенства для диких животных на протяжении США10, 11. Аналогичным образом, провинциальные агентства дикой природы в Канаде включили DRIT в крупномасштабных усилий по эпиднадзору за бешенством в тандеме со своими программами общественного здравоохранения с успехом8. Оба USDA WS и канадских программ наблюдения DRIT использовали национальные справочные лаборатории для подтверждения бешенства DFA и для выполнения вирусного варианта ввода по мере необходимости8. Кроме того, биологи USDA WS на местах отправляют 10% отрицательных образцов для подтверждения DFA в референтные лаборатории и с 2008 года, участвовали в двухгодичном тестировании на знание DRIT, предоставляемом Лабораторией гигиены штата Висконсин, как часть стандартного меры по обеспечению качества.
Цель этого метода заключается в том, чтобы предложить альтернативный подход к диагностическому тестированию на бешенство, который может быть проведен в децентрализованных лабораториях, на местах или в районах, не имеющих регулярного доступа к электронной микроскопии.
Protocol
Representative Results
Discussion
DRIT является гибким методом, пригодным для эпиднадзора на местах для выявления наличия вируса бешенства, который может быть использован в децентрализованных лабораторных районах. Хотя можно провести весь тест в полевых условиях, таких как на задней двери грузовика, идеально будет иметь небольшое, крытое пространство, предназначенное для DRIT из-за химических веществ, оборудования и вопросов хранения. Кроме того, необходимо учитывать соблюдение всех применимых федеральных, государственных и местных законов и правил использования и утилизации химических веществ. В настоящее время USDA WS располагает 15 объектами DRIT для тестирования образцов из 17 штатов. Объекты USDA WS DRIT создаются совместно с университетскими и государственными лабораториями общественного здравоохранения, в специально отведенных помещениях в больших помещениях и в закрытых прицепах, которые были модернизированы и переоборудованы в качестве мобильных испытательных установок в случае чрезвычайной вспышки ответ, где расширение тестирования на наблюдение за бешенством с непосредственным временем оборота имеет решающее значение(рисунок 5).
В то время как тест был успешным с использованием ствола мозга материал переменного качества, свежие ткани ствола мозга без разложения тканей является оптимальным. По мере разложения, высыхания или сжижения качество образца снижается, и тест может обнаружить более неспецифические окрашивания, которые могут запутать результаты. Это наблюдение аналогично между DFA и DRIT2. Brainstem /CNS должны быть собраны как можно скорее, а затем хранитьзамороженные (-20 градусов по Цельсию) до тестирования.
Как правило, большинство объектов USDA WS обрабатываются от 12 до 24 слайдов одновременно во время сеанса DRIT, включая один положительный контроль и один отрицательный контроль, который был подтвержден через DFA. Положительные и отрицательные элементы управления обеспечивают точку отсчета для каждого запуска DRIT для обеспечения успешного проведения теста и подтверждения того, возникают ли на тестовых слайдах вопросы с толкованием. Если образец не установлен, чтобы иметь явный положительный или отрицательный результат, он помечен как неопределенный и проверен ы во второй раз DRIT. Если этот образец не является явным положительным или отрицательным после двух drIT-тестов, он отправляется в референтную лабораторию для DFA или связанных с ним испытаний.
Как и в любом диагностическом тесте, «проблема съемки» полезна при неожиданных находках. Например, если drIT-запуск не удался (т.е. положительный контроль не проявляет интенсивности окрашивания и распределения антигенов в размере 3 или 4 евро), убедитесь, что срок действия всех химических веществ и реагентов не истек. Мы обнаружили, используя недавно открытую бутылку перекиси водорода, как минимум один раз в неделю полезно, чтобы помочь предотвратить неспецифические окрашивания через окисление ткани мозга. Кроме того, мы рекомендуем заменять буфер ацетата не реже одного раза в год, как минимум, независимо от срока годности.
Есть ряд преимуществ DRIT над DFA, включая более низкие затраты, способность выполнять тест за пределами централизованной лаборатории, необходимость только световой микроскопии вместо флуоресцентного микроскопа, и относительно простой процесс обучения для люди, управляющие ичитающие тест 2,3,4. Эти преимущества, в сочетании с чувствительностью и специфичность DRIT, которые сопоставимы с DFA2,7,8,9 уже доказали, что тест служит важным инструментом в широком масштабе расширенные программы эпиднадзора за бешенством8,10 в Северной Америке. Кроме того, ДРИТ обладает потенциалом для расширения эпиднадзора и более оперативного тестирования в развивающихся странах или других районах с ограниченными ресурсами, особенно после недавнего руководства МЭЕ/ВОЗ в качестве рекомендуемого теста.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы признаем всех сотрудников Службы охраны дикой природы Министерства сельского хозяйства США, которые в настоящее время или ранее собрали расширенные образцы эпиднадзора за бешенством и провели DRIT для диагностики бешенства. Кроме того, мы признаем, многие кооператоры, которые помогают нам с расширенной коллекции по борьбе с бешенством. Мы также благодарим Центры по контролю и профилактике заболеваний и Институт Wistar за доступ к критически важным реагентам, необходимым для проведения DRIT и за предоставление возможностей для обучения. Кроме того, мы высоко ценим подтверждаемую диагностику и техническую помощь, оказываемую Центрами по контролю и профилактике заболеваний и Центром Уодсворта при Департаменте здравоохранения штата Нью-йорк. Использование любых коммерческих продуктов предназначено только для целей сравнения и не является одобрением.
Materials
| 3-Amino-9-Ethylcarbazole (AEC tablets; 50 count) | Sigma Aldrich (https://www.sigmaaldrich.com/) | A6926 | |
| Acetate Buffer, 0.1M, 5.2 pH, 32oz | Poly Scientific R&D Corp. (https://www.polyrnd.com/) | s140 | |
| Ag Tek MiniScalpel, PN110, Non-sterile #10, 40 per package | Patterson Veterinary (https://www.pattersonvet.com/) | PN110 | Supplemental equipment for sample touch impressions; Also available through Clipper Distributing (http://www.clipperdist.net/) |
| BD Luer-Lok Disposable Syringe without needle, 10cc | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | 14-823-2A | BD Manufacturer Number 309604 |
| Binocular Light Microscope with Seidentopf Head or equivalent | Multiple Vendors | ||
| Blue Rectangular UN-rated Disposal Container, 5G | Berlin Packaging (https://www.berlinpackaging.com/) | 1147T01BLU | Supplemental equipment for chemical waste storage/disposal (Gill hematoxylin and AEC solution) |
| Corning Square and Rectangular Cover Glass, 24×60 | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | 12-553-465 | Corning Manufacturer Number 2975246 |
| Corning Universal Fit Pipet Tips: Racked, Nonsterile (1-200ul) | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | 07-200-300 | Corning Manufacturer Number 4863 |
| Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes, polypropylene | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | 14-959-70C | Corning Manufacturer Number 352097 |
| Falcon 96-Well Assay Plates (Tissue culture plate lids) | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | 08-772-5 | Corning Manufacturer Number 353910 |
| Fisher Brand 25mm Syringe Filter, Nylon, 0.45um, Sterile | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | 09-719D | |
| Fisher Chemical Gill Method Hematoxylin Stain (Gill-2), 4L | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | CS401-1D | |
| Fisherbrand Sharps-A-Gator Point-of-Use Sharps Containers, 5qt | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | 14-827-122 | Supplemental equipment for proper BSL-2 Laboratory Set-Up |
| Fluoro-Gel with Tris Buffer (Gel/Mount Media), 20mL | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 102092-122 | Fluoro-Gel Substitute for BioMeda™ Gel-Mount, Electron Microscopy Sciences |
| Formalin, Buffered, 10%, 4L | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | SF100-4 | Available each or in case of 4 |
| Gilson Pipetman P200 Pipet, 50-200uL | Daigger Scientific (https://www.daigger.com) | EF9930E | |
| Hy-Clone Phosphate Buffered Saline, 1X Solution, 1L (PBS) | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | SH30256LS | Alternative dry powder product can be used |
| Hydrogen Peroxide, 3% | Multiple Vendors | Any commercially available source, such as pharmacy or store brands, etc. | |
| Lens Microscope Objective 20X and 40X | Multiple Vendors | ||
| Lysol IC Quarternary Disinfecting Cleaner, 1G | Daigger Scientific (https://www.daigger.com) | EF8481 | Supplemental materials for proper BSL-2 Laboratory disinfection |
| Miltex brand Disposable Scalpel Size 22 (alternative size to MiniScalpel) | AMD Next (www.amdnext.com) | 999112314 | Supplemental equipment for sample touch impressions; Alternative size to Ag Tek MiniScalpel |
| N,N-Dimethylformamide, Amber Glass Packaging, 500mL | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | D119-500 | |
| Peroxidase Labeled Streptavidin, 50mL | SeraCare (https://www.seracare.com/) | 5550-0001 | KPL Immunoassay and Kits Reference Number 71-00-38 |
| Phosphate Buffered Saline Powder (alternative to Fisher liquid PBS) | Sigma Aldrich (https://www.sigmaaldrich.com/) | P3813 | Must be prepared in 1L distilled water; Available in quantities of 1, 10 and 50 packs |
| Primary antibody: Polyclonal anti-nucleoprotein or cocktail of anti-lyssavirus biotinylated antibodies | Store at 4 degrees C | ||
| PYREX Disposable Serological Pipets, Glass, Sterile, Plugged, Corning, 1.0mL | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 7078D-1 | VWR Manufacturer Number 89091-220 |
| PYREX Disposable Serological Pipets, Glass, Sterile, Plugged, Corning, 10.0mL | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 7078D-10 | VWR Manufacturer Number 89091-106 |
| PYREX Disposable Serological Pipets, Glass, Sterile, Plugged, Corning, 5.0mL | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 7078D-5 | VWR Manufacturer Number 89091-484 |
| Richard-Allan Scientific Gills Hematoxylin Stain No. 2, 1PT (alternative to above) | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | 22-050-201 | Thermo Scientific Manufacturer Number 72504 |
| Slide Holders, 24-place | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 25608-868 | Sakura®Finetek Supplier Number 4465; Available through multiple vendors |
| Specimen Tin Boxes, 1/2oz | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 101412-452 | Supplemental equipment for storage of brain tissue samples |
| Taylor 2-Event Digital Timer/Clock | Multiple Vendors | Supplemental equipment | |
| Tissue-Tek Slide Staining Kit | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 25608-902 | Sakura®Finetek Supplier Number 4551; Available through multiple vendors |
| TWEEN 80, Polyethylene glycol, 500mL | Sigma Aldrich (https://www.sigmaaldrich.com/) | P1754 | Also available in 25mL, 1L and 1G volumes |
| VWR FLIP Pipette Filler (0.05-100mL) | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 53497-055 | |
| VWR Soft Nitrile Examination Gloves, L (100 per box) | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 89038-272 | Supplemental equipment for proper PPE |
| Water, Deionized (20L) | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 10806-022 | |
| Wheaton Clear Glass Sample Vials, 8mL | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | 06-408C | DWK Life Sciences Manufacturer Number 224884 |
| White Coated, Double Well Pattern Microscope Slides, 14mm | Tekdon Incorporated (https://www.tekdon.com/coated-microscope-slides.html) | 2-140 | |
| White Rectangular UN-rate Disposal Container, 5G | Berlin Packaging (https://www.berlinpackaging.com/) | 1147T01WHT | Supplemental equipment for chemical waste storage/disposal (Formalin) |
References
- Dean, D. J., Abelseth, M. K., Atanasiu, P., Meslin, F. X., Kaplan, M. M., Koprowski, H. . Laboratory techniques in rabies. 23, (1996).
- Durr, S., et al. Rabies diagnosis for developing countries. PLOS Neglected Tropical Diseases. 2 (3), e206 (2008).
- Rupprecht, C., et al. . Progress in the development of a direct rapid immunohistochemical test for diagnosing rabies. , (2014).
- Rupprecht, C. E., et al. Additional Progress in the Development and Application of a Direct, Rapid Immunohistochemical Test for Rabies Diagnosis. Journal of Veterinary Science. 5 (2), (2018).
- Coleman, P. G., Fevre, E. M., Cleaveland, S. Estimating the public health impact of rabies. Emerging Infectious Diseases. 10 (1), 140-142 (2004).
- . . Standard Operating Procedure for the Direct Rapid Immunohistochemistry Test (DRIT) for the detection of rabies virus antigens. , (2016).
- Lembo, T., et al. Evaluation of a direct, rapid immunohistochemical test for rabies diagnosis. Emerging Infectious Diseases. 12 (2), 310-313 (2006).
- Middel, K., Fehlner-Gardiner, C., Pulham, N., Buchanan, T. Incorporating Direct Rapid Immunohistochemical Testing into Large-Scale Wildlife Rabies Surveillance. Tropical Medicine and Infectious Disease. 2 (3), 21 (2017).
- Coetzer, A., Sabeta, C. T., Markotter, W., Rupprecht, C. E., Nel, L. H. Comparison of biotinylated monoclonal and polyclonal antibodies in an evaluation of a direct rapid immunohistochemical test for the routine diagnosis of rabies in southern Africa. PLOS Neglected Tropical Diseases. 8 (9), e3189 (2014).
- Kirby, J., et al. Enhanced Rabies Surveillance to Support Effective Oral Rabies Vaccination of Raccoons in the Eastern United States. Tropical Medicine and Infectious Disease. 2 (3), 34 (2017).
- Slate, D., et al. Oral rabies vaccination in north america: opportunities, complexities, and challenges. PLOS Neglected Tropical Diseases. 3 (12), e549 (2009).
- . Direct Rapid Immunohistochemistry Test (DRIT) protocols Available from: https://rabiessurveillanceblueprint.org/Direct-Rapid-Immunohistochemistry?lang=fr (2019)
- Khalid, A., Haque, A. . Touch Impression Cytology Versus Frozen Section as Intraoperative Consultation Diagnosis. 2, (2004).
