Sorveglianza della rabbia migliorata utilizzando un test immunoistochimico rapido diretto

Ogni persona che conduce test diagnostici sulla rabbia dovrebbe ricevere una serie standard di vaccinazione anti-pre-esposizione e sottoporsi a una valutazione regolare dell’anticorpo sierologico, con le vaccinazioni di richiamo in base alle esigenze. Gli individui non immunizzati non devono entrare nei laboratori o nelle aree in cui tale lavoro è svolto. Tutte le manipolazioni dei tessuti e dei vetrini devono essere condotte per non aerosolizzare liquidi o produrre particelle trasportate dall’aria. Le cappe da fumi non sono necessarie, ma quando sono fattibili possono fornire una protezione extra da odori, ectoparassiti e frammenti ossei. Le attrezzature protettive personali minime, compresi i guanti e la protezione degli occhi, devono essere indossate in ogni momento durante la raccolta e la prova del campione. 1. Collezione Brainstem Raccogliere i campioni del tronco encefalico immediatamente dopo la raccolta della carcassa o assicurarsi che le carcasse vengano collocate nei congelatori per essere immagazzinate fino a dopo i test. Se le carcasse animali sono congelate, scongelare a temperatura ambiente prima della raccolta del tronco encefalico per facilitare la raccolta. In alcune circostanze, i campioni vengono raccolti direttamente da un animale congelato. Per gli animali che sono appena raccolti o che sono stati sconziati a temperatura ambiente, posizionare la supina animale su una superficie piana con la colonna vertebrale cervicale leggermente ruotata verso l’esaminatore. Palpate per identificare l’articolazione atlanto-occipitale sull’aspetto laterale della colonna vertebrale cervicale. Per le carcasse ancora completamente congelate, posizionare la supina animale come descritto sopra, se possibile. Utilizzare seghe, coltelli, cesoie ossee o attrezzature simili per separare completamente la testa dal corpo. NOT:</ Tutte le apparecchiature utilizzate che non sono una tantera devono essere pulite accuratamente tra i campioni. Utilizzando una lama bisturi, fare un’incisione a livello dell’articolazione atlanto-occipitale all’aspetto ventrale, tagliando attraverso tutti gli strati del muscolo e dei tessuti molli, tra cui la trachea e l’esofago. Continuare fino a circa l’aspetto anteriore delle vertebre cervicali della colonna vertebrale. Per i tessuti congelati, utilizzare una lama del bisturi per rimuovere eventuali strati rimanenti di muscolo e tessuti molli per esporre il forame magnum. Spostare la testa dell’animale in estensione di gamma finale fino a quando il tronco encefalico è visibile. Utilizzare una lama bisturi per rimuovere tutto il tessuto visibile del tronco encefalico/sistema nervoso centrale (CNS) per il campionamento. Per un campione congelato, utilizzare una lama del bisturi per rimuovere la maggior parte del tronco encefalico congelato / tessuto CNS possibile dall’interno del cranio. Collocare i campioni del tronco encefalico in un contenitore indistruttibile (ad es. latta di unguento metallico, crio-fiala, ecc.) ed etichettare di conseguenza. Assicurarsi che i campioni del tronco encefalico siano testati immediatamente dopo la raccolta tramite il test DRIT, refrigerati (4 gradi centigradi) per un massimo di 24 h prima del test o congelati (-20 gradi centigradi) fino al momento della prova se il test avrà luogo più di 24 h dopo la raccolta del campione. 2. Preparazione dei materiali per il DRIT Impostazione di 10 piatti di colorazione (Figura 1) NOT:</ I piatti di colorazione sono abbastanza profondi da consentire l’immersione completa del vetrino (diametro 96 mm, altezza 72 mm, profondità 42 mm, volume 250 mL). 6 È possibile: Riempire il piatto 1 con il 10% di formalina tampolatata per fosfato. Sostituire la formalina dopo 2 esecuzioni di test o settimanali. Riempire i piatti 2, 4 e 5 con salina tamponata di fosfato con 1% tween-80 (TPBS). Sostituire con un TPBS aggiornato prima di ogni test. Riempire il piatto 3 con il 3% di perossido di idrogeno. Sostituire il perossido di idrogeno prima di ogni test. Riempire i piatti 6, 8, 9 e 10 con acqua distillata o divinizzata. Sostituire l’acqua prima di ogni test. Riempire il piatto 7 con la formulazione dell’ematossilina Gills #2 diluita in un rapporto 1:1 in acqua distillata6. Sostituire l’ematossilina dopo 2 prove o settimanalmente. NOT:</ Secondo il protocollo DRIT originale sviluppato dal CDC12, un rapporto 1:2 di Gills ematossialina all’acqua può essere utilizzato se la controtendenza è troppo scura. Preparazione della soluzione di stock di amino-ethylcarbazole (AEC) Utilizzando una pipetta di vetro, mettere 5 mL di N,N-dimetilformamide in un contenitore di vetro. Aggiungere una compressa da 20 mg di 3-amino-9-ethylcarbazole e agitare fino a completa dissoluzione. Etichettare il barattolo con “AEC stock” e la data in cui è stato fatto il titolo. NOT:</ La soluzione di stock AEC può essere conservata in frigorifero (4 gradi centigradi) e utilizzata per 1-2 mesi. Preparazione della diluizione del lavoro AEC Aggiungere 7 mL di tampone in acetato a un tubo di centrifuga di 15 mL. Utilizzando una pipetta di vetro, aggiungere 0,5 mL della soluzione di riserva AEC al tubo di centrifuga. Aggiungere al tubo 0,075 mL di perossido di idrogeno del 3%. Filtrare la soluzione con una siringa da 10 mL utilizzando un filtro di siringa da 0,45 m. NOT:</ La diluizione di lavoro AEC deve essere creata appena prima di ogni test DRIT in quanto è stabile solo per 2-3 h. 3. Test di immunoistochimica rapida diretta Etichetta vetrini al microscopio in vetro con un numero unico per ogni campione utilizzando un pennarello permanente resistente agli sbavature, impermeabile. Utilizzando una lama bisturi, rimuovere il tronco encefalico dal contenitore e posizionare su carta assorbente. Asciugare delicatamente qualsiasi eccesso di liquido, sangue o pelliccia con un secondo tovagliolo di carta per rivelare solo il tessuto del tronco encefalico13. Se necessario, sezionare il tessuto del tronco encefalico per rivelare una sezione trasversale. Toccare delicatamente il vetrino del microscopio alla sezione trasversale del tessuto del tronco encefalico. Toccare la diapositiva sul tronco encefalico in diversi punti senza movimento laterale per consentire il trasferimento di più aree del tronco encefalico alla diapositiva13. Assicurarsi che solo 1 o 2 strati di cellule vengono trasferiti dal tessuto cerebrale alla diapositiva con un tocco delicato. Non è necessario alcun agente di montaggio per apporre il tessuto del tronco encefalico ai vetrini. Includere un controllo positivo e negativo in ogni esecuzione DRIT. Lasciare asciugare all’aria i vetrini ad aria per circa 5 min a temperatura ambiente. Immergere le diapositive in una formalina tampobuffer al 10% per 10 min (piatto 1). Togliere i vetrini dalla formalità e risciacquare in una soluzione di TPBS (piatto 2). Immergere i vetrini nel perossido di idrogeno del 3% per 10 min (piatto 3). Togliere i vetrini dal perossido di idrogeno e risciacquare in TPBS fresco (piatto 4). Dopo aver rimosso il perossido di idrogeno in eccesso, posizionare i vetrini in TPBS fresco (piatto 5) e lavorare con una diapositiva alla volta mentre gli altri vetrini rimangono immersi nel TPBS. Prendere le diapositive dal TPBS (piatto 5) uno alla volta, scrollarsi di dosso e macchiare tampone in eccesso, e mettere su un tovagliolo di carta inumidito sul banco di laboratorio, come base di una ‘camera di umidità’. Utilizzando una pipetta, cadere abbastanza anticorpo primario virus anti-rabies su ogni diapositiva per coprire il tessuto CNS. Incubare i vetrini per 10 minuti nella camera di umidità (cioè, coprendo i vetrini con piastre e altre lastre semplici mentre sono posati sul tovagliolo di carta inumidito) a temperatura ambiente (Figura 2). Togliere i vetrini dalla camera di umidità, agitare e cancellare il coniugato in eccesso e sciacquare i vetrini in TPBS (riutilizzare lo stesso TPBS nel piatto 5). Lavorando con una diapositiva alla volta, mentre altri rimangono immersi in TPBS – utilizzare una pipetta per far cadere abbastanza complesso streptavidin-peroxidase per coprire il tessuto CNS. Incubare nella camera di umidità per 10 min a temperatura ambiente. Togliere i vetrini dalla camera di umidità, agitare e soffiare il complesso in eccesso e sciacquare i vetrini in TPBS (piatto 5). Lavorando con una diapositiva alla volta, scrollarsi di dosso e macchiare tampone in eccesso, mentre altri rimangono immersi in TPBS – utilizzare una pipetta per cadere abbastanza AEC (preparazione è spiegato sopra e dovrebbe essere fatto immediatamente prima dell’uso) per coprire il tessuto CNS. Incubare nella camera di umidità per 10 min a temperatura ambiente. Sciacquare i vetrini in acqua distillata (piatto 6). Mettere i vetrini nella contromacchia di Gills Hematoxylin (diluito 1:1 con acqua distillata) per 2 min (piatto 7). Immediatamente immergere tutti gli scivoli in acqua distillata (piatto 8). Ripetere due volte con acqua dolce ogni volta (piatti 9 e 10). Lavorando con una diapositiva alla volta, mentre altri rimangono immersi in acqua distillata (piatto 10) – agitare e macchiare l’acqua in eccesso e utilizzare un mezzo di montaggio solubile in acqua per apporre uno slittamento di copertura. Utilizzare un microscopio luminoso con un obiettivo 20x per visualizzare i vetrini e un obiettivo 40x se è necessaria un’ispezione più approfondita.