Doğrudan hızlı Immünhistokimyasal testi kullanarak gelişmiş kuduz gözetimi
Summary
Doğrudan hızlı immünhistokimyasal test (DRIT), kuduz tanısı için doğrudan floresan antikor (DFA) testine alternatif olarak tanınan hayvan sağlığı ve Dünya Sağlık Örgütü (OIS/WHO) için bir dünya organizasyonu sunmaktadır. Bu test, ışık mikroskobu kullanarak beyin gösterimleri üzerine yaklaşık 1 saat içinde gerçekleştirilebilecek alan tabanlı uygulamalar için izin verir.
Abstract
Laboratuvar bazlı gözetim, kuduz önleme, kontrol ve yönetim çabalarının ayrılmaz bir parçasıdır. DFA kuduz tanısı için altın standart iken, özellikle gelişmekte olan ülkelerde, kuduz gözetimi geliştirmek için ek tanı teknikleri doğrulamak için bir ihtiyaç vardır. Burada, DFA ‘ya kıyasla ışık mikroskobu kullanan alternatif, laboratuvar veya alan tabanlı test seçeneği olarak DRIT için standart bir protokol sunuyoruz. Şüpheli hayvanlardan toplanan beyin dokusunun dokunmatik gösterimleri% 10 tamponlu formalin içinde sabitlenir. Drit kuduz virüs özgü monoklonal veya poliklonal antikorlar kullanır (biotin için konjuyum), bir streptavidin-peroksidaz enzim, ve bir Kromojen muhabiri (Asetil 3-amino-9-etilcarbazol gibi) enfekte doku içinde viral kapanımlar tespit etmek. Yaklaşık 1 saat içinde, bir beyin dokusu örneği test edilebilir ve DRIT tarafından yorumlanır. Kuzey Amerika, Asya, Afrika ve Avrupa ‘daki türlerin çeşitli test şüpheli hayvan beyni değerlendirilmesi DFA kıyasla sonuçları ile% 100 yaklaşıyor DRIT tarafından yüksek hassasiyet ve özgüllük resimli var. 2005 yılından bu yana, ABD Tarım Bölümü yaban hayatı Hizmetleri (USDA WS) programı, stratejik kuduz yönetim alanlarında yaban hayatı toplanan > 94000 örnekleri test etmek için DRIT kullanarak büyük ölçekli gelişmiş kuduz gözetim çabaları gerçekleştirdi . DRıT, laboratuvarlar ve alan biyologlar tarafından mevcut kuduz gözetimi, önleme ve kontrol programlarını küresel olarak iyileştirmek için kullanılabilecek kuduz tanısı için güçlü ve ekonomik bir araç sağlar.
Introduction
DFA rutin kuduz tanı1için en yaygın olarak kullanılan test iken, satın alma ve floresan mikroskop Bakımı maliyeti gelişmekte olan Milletler2,3,4 ve geniş için sınırlandırılabilir, büyük ölçekli gelişmiş kuduz gözetim programları3,4. Buna ek olarak, DFA sabitleme sırasında numunelerin soğutulmasını ve antikor-antijen reaksiyonları sırasında ortam sıcaklığının üstündeki numunelerin inkübasyon yapılmasını gerektirir, bu da uygun altyapı olmaksızın ülkelerde önemli bir engel olabilir. Modern DFA testi ile ilişkili sınırlamalar kısmen nedeniyle, kuduz küresel etkisi uzun5hafife edilmiştir.
Bu bağlamda, özellikle gelişmekte olan ülkelerde, küresel kuduz gözetimi geliştirmek için ek tanı teknikleri doğrulamak için bir ihtiyaç vardır. Burada sunulan DRıT protokolü, ışık mikroskobu kullanan DFA ‘ya bir laboratuar veya alan bazlı test alternatifi sunar ve test6‘ da soğutma veya laboratuar kuluçarı gerektirmez. DRIT ve DFA her iki teknikleri potansiyel kuduz hayvanların toplanan beyin örnekleri dokunmatik Gösterim kullanmak benzer. Ancak, DRıT ilk adımı örnekleri için tarihsel bir fiktatif olarak formalin kullanır, hangi kuduz virüsü inaktive. Bu DFA protokolünde örnekleri düzeltmek için kullanılan aseton üzerinde önemli bir Biyogüvenlik iyileştirme sağlar3, hangi sadece Laboratuar ama belki de daha çok alan tabanlı veya merkezi olmayan laboratuar ortamlarında önemlidir. Bugüne kadar, drit hassasiyet ve özgüllüğü DFA2,7,8,9eşit gösterir.
2005 yılından bu yana, USDA WS programı kapsamlı bir yaban hayatı kuduz yönetim programı10bir parçası olarak drıt kullanarak Kuzey Amerika ‘da büyük ölçekli gelişmiş kuduz gözetim çabaları gerçekleştirdi. Gelişmiş kuduz gözetim pozlama tabanlı kamu sağlığı gözetim ve testler öncelikle yaban hayatı meso-etobur türler, rakunlar (Procyon rakun), çizgili skunks (kokarca kokarca), gri tilki (dahil olmak üzere tamamlayıcı olarak kullanılır Urocyon cinereoargenteus), kırmızı tilki (Vulpes vulpes), ve (Canis Latrans) Bu bir insan veya yerli hayvan maruz yer olmamıştır. Test kullanılan hayvan karkas gelişmiş kuduz gözetim çabaları ve oluşan kuduz vektör türleri ile USDA WS gönderildi: hasta veya garip oyunculuk; ölü, yol öldürüldü, ya da bir sıkıntı bulundu; ve bir insan veya yerli hayvan maruz kalma ile ilişkili değildir. DRıT kuduz gözetimi geliştirmek ve kamu sağlığı tanı laboratuvarlarının10mali yükü ve iş yükünü azaltmak için az veya hiç laboratuar deneyimi ile eğitimli alan biyologlar tarafından istihdam edilebilir bir kuduz teşhis testi sağlar. USDA WS alan çalışanları için temel DRıTT eğitim genellikle 1,5 alır 2 gün, yaklaşık içerir 4 biyalik temel ilkelerini kapsayan sınıf öğretim h, örnek toplama ve DRIT süreçleri için yöntemler yanı sıra > 8 h testi yürüten laboratuar süresi. Eğitim fırsatları USDA WS ve program kooperatörler için hastalık kontrol ve önleme (CDC), LYSSA LLC ve Wistar Enstitüsü merkezleri aracılığıyla kullanılabilir olmuştur.
Stratejik yönetim alanlarında, USDA WS üzerinde test edilmiştir 94.000 yaban hayatı örnekleri DRıTT kullanarak ve büyük olasılıkla sadece pozlama dayalı kamu sağlığı test şüpheli hayvanların dayanarak tespit edilmemiş gitti 1.850 kuduz örnekleri tespit etti. DRıT sonuçları tarafından sağlanan gelişmiş kuduz gözetim verileri ABD ‘de yaban hayatı için oral kuduz aşılama programlarının destek peyzaj üzerinde kuduz daha tam temporal ve uzamsal temsili sağlamak için önemlidir10, 11‘ den itibaren. Benzer şekilde, Kanada ‘da Il yaban hayatı kurumları başarı ile kendi kamu sağlığı programları ile tandem büyük ölçekli yaban hayatı kuduz gözetim çabaları içine DRIT dahil var8. Hem USDA WS ve Kanada DRIT gözetim programları DFA tarafından kuduz onaylamak ve uygun8olarak viral varyant yazarak gerçekleştirmek için Ulusal referans laboratuvarları kullandık. Dahası, USDA WS alan biyologlar, DFA onayı için negatif numunelerin% 10 ‘ unun referans laboratuvarlara göndermesi ve 2008 yılından bu yana, Wisconsin Devlet hijyen Laboratuvarı tarafından sağlanan yıllık DRIT yeterlilik testine, standart bir parçası olarak katıldı kalite güvencesi önlemleri.
Bu yöntemin amacı, merkezi olmayan laboratuvarlarda yapılabilir kuduz teşhis testi için alternatif bir yaklaşım sunacaktır, alanda, veya elektron mikroskobu rutin erişim olmaksızın alanlarda.
Protocol
Representative Results
Discussion
DRIT, merkezi olmayan laboratuar alanlarında kullanılabilecek kuduz virüsü varlığını tespit etmek için alan tabanlı gözetim için uygun esnek bir yöntemdir. Bir kamyonun Bagaj Kapısı gibi alan tabanlı bir ortamda tüm testi yapmak mümkün olsa da, kimyasal, ekipman ve tedarik depolama sorunları nedeniyle DRIT için adanmış küçük, kapalı bir alan olması idealdir. Ayrıca, yürürlükteki tüm federal, eyalet ve yerel yasalara ve kimyasal kullanım ve bertaraf yönetmeliklerine bağlılık dikkate alınmalıdır. Şu anda, USDA WS 17 devletten örnekleri test etmek için 15 DRIT tesisleri vardır. USDA WS DRIT tesisleri, üniversite ve devlet kamu sağlığı laboratuvarları ile birlikte, daha büyük tesisler içinde belirlenmiş odalarda ve retrodonatılmış ve mobil test birimleri olarak hizmet etmek için dönüştürülmüş kapalı römork ile kurulmuş Acil bir salgın tepkisi durumunda, hızlı dönüş süresi ile gelişmiş kuduz gözetim testleri önemlidir (Şekil 5).
Test, değişken kalitedeki beyin sapı malzemesi kullanılarak başarılı olurken, doku debileşemesiyle taze beyin sapı dokusu optimum seviyede. Ayrışma, kurutma veya sıvılaşma ortaya çıktığında, numune kalitesi azalır ve test sonuçları karıştırabilecek daha spesifik olmayan lekeyi algılayabilir. Bu gözlem DFA ve DRIT2arasında benzer. Beyin sapı/CNS en kısa sürede toplanmalı ve daha sonra test edene kadar dondurulmuş (-20 °C) depolanmalıdır.
Genellikle, bir pozitif kontrol ve DFA ile teyit edilmiş bir negatif kontrol dahil olmak üzere bir DRIT oturumu sırasında bir kerede 12-24 slaytlar çoğu USDA WS tesisleri işlemi. Pozitif ve negatif denetimler, testin başarılı olduğundan emin olmak için her DRIT çalışması için bir referans noktası sağlar ve test slaytlarında yorumlayıcı sorular ortaya çıkarsa onaylamak için. Bir örnek net bir pozitif veya negatif sonuca sahip olduğu belirlenmişse, bir belirsiz olarak etiketlenmiş ve ikinci kez DRIT tarafından test. Bu örnek iki DRIT testinden sonra net bir pozitif veya negatif değilse, DFA veya ilgili testler için bir başvuru laboratuvarına gönderilir.
Herhangi bir tanılama testinde olduğu gibi, ‘ sorun giderme ‘ beklenmeyen bulgularla yararlıdır. Örneğin, bir DRIT çalışması başarısız olursa (yani, pozitif kontrol + 3 veya + 4 boyama yoğunluğu ve antijen dağılımı göstermez), tüm kimyasalların ve reaktiflerin süresi dolmadığından emin olun. Biz haftada bir kez en az bir hidrojen peroksit yeni açılan şişe kullanarak bulduk beyin dokusunun oksidasyonu ile spesifik olmayan boyama önlemeye yardımcı olmak için yararlıdır. Ayrıca, etiketlenmiş son kullanma tarihi ne olursa olsun, asetat tamponunu her yıl en az bir kez değiştirmenizi öneririz.
Düşük maliyetler de dahil olmak üzere DFA üzerinden DRıT avantajları bir dizi vardır, merkezi bir laboratuar dışında test yapmak için yeteneği, bir floresan mikroskop yerine sadece ışık mikroskopisi için ihtiyaç, ve nispeten basit eğitim süreci insanlar test2,3,4yönetmek ve okuma. Bu avantajlar, DFA2,7,8,9 ile karşılaştırılabilir olan drit duyarlılık ve özgüllüğü ile birleştiğinde zaten test geniş ölçekte önemli bir araç olarak hizmet olduğunu kanıtlamıştır Gelişmiş kuduz gözetim programları8,10 Kuzey Amerika ‘da. Ayrıca, DRıTT artan gözetim ve daha fazla istem testleri geliştirme ülkeleri veya sınırlı kaynaklara sahip diğer alanlarda, özellikle son OIS/WHO rehberlik önerilen bir test olarak sonra izin olasılığı vardır.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz şu anda veya daha önce geliştirilmiş kuduz gözetim örnekleri toplanan tüm USDA Wildlife Services personeli kabul ve kuduz tanı için DRIT gerçekleştirdi. Aynı şekilde, gelişmiş kuduz gözetim koleksiyonu ile bize yardımcı olan birçok koişletmecileri kabul ediyoruz. Ayrıca, DRıT yürütmek ve eğitim fırsatları sağlamak için gerekli kritik reaktiflere erişim için hastalık kontrol ve Önleme Merkezleri ve Wistar Enstitüsü ‘ne teşekkür ederiz. Buna ek olarak, hastalık kontrol ve Önleme Merkezleri tarafından ve New York Devlet Sağlık Bakanlığı ile Wadsworth Center tarafından sağlanan teyit edilen teşhis ve teknik yardımları takdir ediyoruz. Herhangi bir ticari ürünün kullanımı sadece karşılaştırma amaçlıdır ve onay teşkil etmez.
Materials
| 3-Amino-9-Ethylcarbazole (AEC tablets; 50 count) | Sigma Aldrich (https://www.sigmaaldrich.com/) | A6926 | |
| Acetate Buffer, 0.1M, 5.2 pH, 32oz | Poly Scientific R&D Corp. (https://www.polyrnd.com/) | s140 | |
| Ag Tek MiniScalpel, PN110, Non-sterile #10, 40 per package | Patterson Veterinary (https://www.pattersonvet.com/) | PN110 | Supplemental equipment for sample touch impressions; Also available through Clipper Distributing (http://www.clipperdist.net/) |
| BD Luer-Lok Disposable Syringe without needle, 10cc | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | 14-823-2A | BD Manufacturer Number 309604 |
| Binocular Light Microscope with Seidentopf Head or equivalent | Multiple Vendors | ||
| Blue Rectangular UN-rated Disposal Container, 5G | Berlin Packaging (https://www.berlinpackaging.com/) | 1147T01BLU | Supplemental equipment for chemical waste storage/disposal (Gill hematoxylin and AEC solution) |
| Corning Square and Rectangular Cover Glass, 24×60 | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | 12-553-465 | Corning Manufacturer Number 2975246 |
| Corning Universal Fit Pipet Tips: Racked, Nonsterile (1-200ul) | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | 07-200-300 | Corning Manufacturer Number 4863 |
| Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes, polypropylene | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | 14-959-70C | Corning Manufacturer Number 352097 |
| Falcon 96-Well Assay Plates (Tissue culture plate lids) | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | 08-772-5 | Corning Manufacturer Number 353910 |
| Fisher Brand 25mm Syringe Filter, Nylon, 0.45um, Sterile | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | 09-719D | |
| Fisher Chemical Gill Method Hematoxylin Stain (Gill-2), 4L | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | CS401-1D | |
| Fisherbrand Sharps-A-Gator Point-of-Use Sharps Containers, 5qt | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | 14-827-122 | Supplemental equipment for proper BSL-2 Laboratory Set-Up |
| Fluoro-Gel with Tris Buffer (Gel/Mount Media), 20mL | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 102092-122 | Fluoro-Gel Substitute for BioMeda™ Gel-Mount, Electron Microscopy Sciences |
| Formalin, Buffered, 10%, 4L | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | SF100-4 | Available each or in case of 4 |
| Gilson Pipetman P200 Pipet, 50-200uL | Daigger Scientific (https://www.daigger.com) | EF9930E | |
| Hy-Clone Phosphate Buffered Saline, 1X Solution, 1L (PBS) | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | SH30256LS | Alternative dry powder product can be used |
| Hydrogen Peroxide, 3% | Multiple Vendors | Any commercially available source, such as pharmacy or store brands, etc. | |
| Lens Microscope Objective 20X and 40X | Multiple Vendors | ||
| Lysol IC Quarternary Disinfecting Cleaner, 1G | Daigger Scientific (https://www.daigger.com) | EF8481 | Supplemental materials for proper BSL-2 Laboratory disinfection |
| Miltex brand Disposable Scalpel Size 22 (alternative size to MiniScalpel) | AMD Next (www.amdnext.com) | 999112314 | Supplemental equipment for sample touch impressions; Alternative size to Ag Tek MiniScalpel |
| N,N-Dimethylformamide, Amber Glass Packaging, 500mL | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | D119-500 | |
| Peroxidase Labeled Streptavidin, 50mL | SeraCare (https://www.seracare.com/) | 5550-0001 | KPL Immunoassay and Kits Reference Number 71-00-38 |
| Phosphate Buffered Saline Powder (alternative to Fisher liquid PBS) | Sigma Aldrich (https://www.sigmaaldrich.com/) | P3813 | Must be prepared in 1L distilled water; Available in quantities of 1, 10 and 50 packs |
| Primary antibody: Polyclonal anti-nucleoprotein or cocktail of anti-lyssavirus biotinylated antibodies | Store at 4 degrees C | ||
| PYREX Disposable Serological Pipets, Glass, Sterile, Plugged, Corning, 1.0mL | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 7078D-1 | VWR Manufacturer Number 89091-220 |
| PYREX Disposable Serological Pipets, Glass, Sterile, Plugged, Corning, 10.0mL | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 7078D-10 | VWR Manufacturer Number 89091-106 |
| PYREX Disposable Serological Pipets, Glass, Sterile, Plugged, Corning, 5.0mL | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 7078D-5 | VWR Manufacturer Number 89091-484 |
| Richard-Allan Scientific Gills Hematoxylin Stain No. 2, 1PT (alternative to above) | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | 22-050-201 | Thermo Scientific Manufacturer Number 72504 |
| Slide Holders, 24-place | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 25608-868 | Sakura®Finetek Supplier Number 4465; Available through multiple vendors |
| Specimen Tin Boxes, 1/2oz | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 101412-452 | Supplemental equipment for storage of brain tissue samples |
| Taylor 2-Event Digital Timer/Clock | Multiple Vendors | Supplemental equipment | |
| Tissue-Tek Slide Staining Kit | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 25608-902 | Sakura®Finetek Supplier Number 4551; Available through multiple vendors |
| TWEEN 80, Polyethylene glycol, 500mL | Sigma Aldrich (https://www.sigmaaldrich.com/) | P1754 | Also available in 25mL, 1L and 1G volumes |
| VWR FLIP Pipette Filler (0.05-100mL) | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 53497-055 | |
| VWR Soft Nitrile Examination Gloves, L (100 per box) | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 89038-272 | Supplemental equipment for proper PPE |
| Water, Deionized (20L) | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 10806-022 | |
| Wheaton Clear Glass Sample Vials, 8mL | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | 06-408C | DWK Life Sciences Manufacturer Number 224884 |
| White Coated, Double Well Pattern Microscope Slides, 14mm | Tekdon Incorporated (https://www.tekdon.com/coated-microscope-slides.html) | 2-140 | |
| White Rectangular UN-rate Disposal Container, 5G | Berlin Packaging (https://www.berlinpackaging.com/) | 1147T01WHT | Supplemental equipment for chemical waste storage/disposal (Formalin) |
References
- Dean, D. J., Abelseth, M. K., Atanasiu, P., Meslin, F. X., Kaplan, M. M., Koprowski, H. . Laboratory techniques in rabies. 23, (1996).
- Durr, S., et al. Rabies diagnosis for developing countries. PLOS Neglected Tropical Diseases. 2 (3), e206 (2008).
- Rupprecht, C., et al. . Progress in the development of a direct rapid immunohistochemical test for diagnosing rabies. , (2014).
- Rupprecht, C. E., et al. Additional Progress in the Development and Application of a Direct, Rapid Immunohistochemical Test for Rabies Diagnosis. Journal of Veterinary Science. 5 (2), (2018).
- Coleman, P. G., Fevre, E. M., Cleaveland, S. Estimating the public health impact of rabies. Emerging Infectious Diseases. 10 (1), 140-142 (2004).
- . . Standard Operating Procedure for the Direct Rapid Immunohistochemistry Test (DRIT) for the detection of rabies virus antigens. , (2016).
- Lembo, T., et al. Evaluation of a direct, rapid immunohistochemical test for rabies diagnosis. Emerging Infectious Diseases. 12 (2), 310-313 (2006).
- Middel, K., Fehlner-Gardiner, C., Pulham, N., Buchanan, T. Incorporating Direct Rapid Immunohistochemical Testing into Large-Scale Wildlife Rabies Surveillance. Tropical Medicine and Infectious Disease. 2 (3), 21 (2017).
- Coetzer, A., Sabeta, C. T., Markotter, W., Rupprecht, C. E., Nel, L. H. Comparison of biotinylated monoclonal and polyclonal antibodies in an evaluation of a direct rapid immunohistochemical test for the routine diagnosis of rabies in southern Africa. PLOS Neglected Tropical Diseases. 8 (9), e3189 (2014).
- Kirby, J., et al. Enhanced Rabies Surveillance to Support Effective Oral Rabies Vaccination of Raccoons in the Eastern United States. Tropical Medicine and Infectious Disease. 2 (3), 34 (2017).
- Slate, D., et al. Oral rabies vaccination in north america: opportunities, complexities, and challenges. PLOS Neglected Tropical Diseases. 3 (12), e549 (2009).
- . Direct Rapid Immunohistochemistry Test (DRIT) protocols Available from: https://rabiessurveillanceblueprint.org/Direct-Rapid-Immunohistochemistry?lang=fr (2019)
- Khalid, A., Haque, A. . Touch Impression Cytology Versus Frozen Section as Intraoperative Consultation Diagnosis. 2, (2004).
