直接急速な免疫組織化学試験を用いた狂犬病サーベイランスの強化

狂犬病診断検査を行う各人は、標準的な曝露前狂犬病ワクチン接種シリーズを受け取り、必要に応じてブースター免疫を伴う定期的な血清抗体評価を受けるべきである。予防接種を受けていない個人は、そのような作業が行われる実験室や領域に入ってはならない。組織およびスライドのすべての操作は、液体をエアロゾル化したり、空気中の粒子を生成しないように行われるべきです。ヒュームフードは必要ありませんが、可能な場合には、臭気、エクトパラサイト、および骨片から余分な保護を提供することができます。手袋や目の保護を含む最小限の個人用保護具は、サンプルの収集とテスト中に常に着用する必要があります。 1. ブレインステムコレクション 死体採取直後に脳幹サンプルを採取するか、死体が後で検査するまで冷凍庫に保管されていることを確認します。動物の死体が凍結されている場合は、収集を容易にするために、脳幹収集の前に周囲温度で解凍します。状況によっては、サンプルは凍結動物から直接採取されます。 新たに採取された動物や周囲温度に解凍された動物の場合は、子宮頸椎を検査官に向かってわずかに回転させた平らな表面に動物のスパインを配置します。子宮頸椎の側面に対するアトラント後頭関節を同定する触診。 まだ完全に凍結している死体の場合は、実用的であれば、上記のように動物のスフィンを配置します。のこぎり、ナイフ、骨せん断または同様の機器を使用して、頭部を体から完全に分離します。注:1回限り使用しないすべての機器は、サンプル間で十分に洗浄する必要があります。 メスブレードを使用して、気管および食道を含む筋肉および軟部組織のすべての層を切断し、腹部の側面でアトラント後頭関節のレベルで切開を行う。頸椎椎の前部の側面を近似するまで続けます。凍結組織の場合は、メスブレードを使用して筋肉と軟部組織の残りの層を除去し、前頭骨を露出させます。 脳幹が見えるまで、動物の頭部をエンドレンジ延長に移動します。メスブレードを使用して、サンプリング用のすべての可視脳幹/中枢神経系(CNS)組織を除去します。凍結サンプルの場合は、メスブレードを使用して、頭蓋骨の内部からできるだけ多くの凍結脳幹/CNS組織を除去します。 脳幹サンプルを壊れない容器(金属のチントスズ、クライオバイアルなど)に入れ、それに応じてラベルを付けます。 DRIT試験を介して収集直後に脳幹サンプルを検査し、試験前に最大24時間冷蔵(4°C)、またはサンプル収集後24時間以上の検査が行われるかどうかのテスト時まで凍結(-20°C)を確認してください。 2. DRIT用材料の準備 スライド染色皿10枚の設定(図1)注:染色皿はスライドの完全な浸漬を可能にするのに十分な深さである(直径96のmm、高さ72のmm、深さ42のmm、容積250 mL)。6 10%リン酸緩衝ホルマリンで皿1を充填します。2 回のテスト実行後または毎週、ホルマリンを交換してください。 皿2、4、5をリン酸緩衝生理食生を1%の1%の12en-80(TPBS)で満たします。各テストの前に、新鮮な TPBS に置き換えます。 皿3を3%過酸化水素で満たします。各試験の前に過酸化水素を交換してください。 皿6、8、9、および10を蒸留水または脱イオン水で充填します。各テストの前に水を交換してください。 ジルヘマトキシリン製剤で皿7を充填#2蒸留水6で1:1比で希釈した。2 回のテスト実行または毎週のテストの実行後にヘマトキシリンを交換します。.注:CDC12によって開発された元のDRITプロトコルによると、逆染色が暗すぎる場合、水に対するギルスヘマトキシリンの1:2の比率が使用されてもよい。 アミノエチルカルバゾール(AEC)ストックソリューションの調製 ガラスピペットを使用して、5 mLのN-ジメチルホルミドをガラス容器に入れます。 3-アミノ-9-エチルカルバゾールの20mg錠剤を1錠加え、完全に溶解するまで振ります。瓶に「AEC在庫」と在庫が作られた日付にラベルを付けます。注:AECのストックソリューションは、冷凍(4°C)の下で保存し、1〜2ヶ月間使用することができます。 AEC作業希釈の準備 15 mL遠心管にアセテートバッファーの7 mLを追加します。 ガラスピペットを使用して、遠心管にAECストック溶液の0.5 mLを追加します。 チューブに3%過酸化水素の0.075 mLを追加します。 0.45 μmのシリンジフィルターを使用して、10 mLシリンジで溶液をろ過します。注:AECの作業希釈は、2~3時間しか安定しており、各DRIT試験の直前に作成する必要があります。 3. 直接急速免疫組織化学試験 ラベルガラス顕微鏡スライドは、スミアプルーフ、防水、永久インクマーカーを使用して、各標本に固有の番号を持つ。 メスブレードを使用して、容器から脳幹を取り出し、ペーパータオルの上に置きます。2枚目のペーパータオルで過剰な液体、血液、または毛皮をそっとふくらまして、脳幹組織13だけを明らかにする。必要に応じて、脳幹組織を切り取って断面を明らかにする。 非常に穏やかに脳幹組織の断面に顕微鏡スライドに触れます。横運動なしでいくつかの点で脳幹にスライドをタッチして、脳幹の複数の領域をスライド13に転送できるようにします。細胞の1つまたは2つの層だけが穏やかなタッチで脳組織からスライドに移されることを確認してください。スライドに脳幹組織を貼り付けるために取り付け剤は必要ありません。各 DRIT 実行に正と負の両方のコントロールを含めます。 スライドを室温で約5分間空気乾燥させます。 スライドを10%バッファリングホルマリンに10分間浸します(皿1)。 TPBS(皿2)の溶液中のホルマリンとディップリンスからスライドを取り外します。 スライドを3%過酸化水素に10分間浸します(皿3)。 過酸化水素からスライドを取り出し、新鮮なTPBS(皿4)で浸す。余分な過酸化水素を除去した後、スライドを新鮮なTPBS(皿5)に入れ、他のスライドがTPBSに浸漬している間、一度に1つのスライドで作業します。 TPBS(皿5)のスライドを一度に1つずつ取り、余分なバッファーを振り落とし、湿ったペーパータオルの上に置き、「湿度室」の基礎として、ラボのベンチに置きます。ピペットを使用して、CNS組織をカバーするために各スライドに十分な原発抗狂犬病ウイルス抗体をドロップします。湿度室で10分間スライドをインキュベートします(つまり、湿ったペーパータオルの上に置いている間に、ウェルプレートやその他のシンプルなカバーでスライドを覆います)(図2)。 湿度室からスライドを取り外し、余分なコンジュゲートを振ってブロットし、TPBSのスライドをディップリンスします(皿5で同じTPBSを再利用します)。 一度に1つのスライドで作業し、他の人がTPBSに浸漬している間 – CNS組織をカバーするのに十分なストレプトアビジンペルオキシダーゼ複合体をドロップするためにピペットを使用してください。室温で10分間湿度室でインキュベートします。 湿度室からスライドを取り外し、余分な複合体を振ってブロットし、TPBS(皿5)でスライドをすすいでください。 一度に1つのスライドで作業し、余分なバッファを振り落とし、他の人がTPBSに浸漬したままである間-十分なAECを落とすためにピペットを使用します(準備は上記で説明され、使用する直前に行われるべきです)CNS組織をカバーする必要があります。室温で10分間湿度室でインキュベートします。 スライドを蒸留水(皿6)で浸す。 スライドをギルス・ヘマトキシリン(蒸留水で希釈1:1)のカウンターステインに2分間置きます(皿7)。 すぐに蒸留水(皿8)ですべてのスライドを浸す。毎回淡水で2回繰り返します(皿9と10)。 一度に1つのスライドで作業し、他の人が蒸留水(皿10)に浸漬したままである間、余分な水を振って消し、カバースリップを貼り付けるために水溶性の取り付け媒体を使用します。 20倍の目的を持つ小顕微鏡を使用して、スライドを表示し、詳細な検査が必要な場合は40倍の目的を見ます。