تعزيز مراقبة داء الكلب باستخدام اختبار سريع مباشر للمناعة الكيميائية
Summary
يوفر الاختبار المناعي المناعي السريع المباشر (DRIT) بديلاً معترفاً به من قبل المنظمة العالمية لصحة الحيوان ومنظمة الصحة العالمية (OIE/WHO) لاختبار الأجسام المضادة الفلورية المباشرة (DFA) لتشخيص داء الكلب. يسمح هذا الاختبار للتطبيقات الميدانية التي يمكن تنفيذها في حوالي 1 ساعة على انطباعات الدماغ باستخدام الفحص المجهري الخفيف.
Abstract
والمراقبة المختبرية جزء لا يتجزأ من جهود الوقاية من داء الكلب ومكافحته وإدارته. وفي حين أن وزارة الخارجية هي المعيار الذهبي لتشخيص داء الكلب، فإن هناك حاجة إلى التحقق من صحة تقنيات التشخيص الإضافية لتحسين مراقبة داء الكلب، ولا سيما في البلدان النامية. هنا، نقدم بروتوكول قياسي لDRIT كخيار اختبار بديل أو مختبري أو ميداني يستخدم الفحص المجهري الخفيف مقارنة بـ DFA. يتم إصلاح انطباعات اللمس من أنسجة الدماغ التي تم جمعها من الحيوانات المشتبه بها في 10٪ رسميا. يستخدم DRIT أجسام مضادة أحادية النسيلة أو متعددة النسيلة خاصة بفيروس الكلب (مترافقة مع البيوتين)، وأنزيم streptavidin-peroxidase، ومراسل كروموجين (مثل أسيتيل 3-أمينو-9-إيثيلكاربازول) للكشف عن التضمينات الفيروسية داخل الأنسجة المصابة. في حوالي 1 ساعة، يمكن اختبار عينة أنسجة الدماغ وتفسيرها من قبل DRIT. وقد أظهر تقييم العقول الحيوانية المشتبه فيها التي تم اختبارها من مجموعة متنوعة من الأنواع في أمريكا الشمالية وآسيا وأفريقيا وأوروبا حساسية عالية وخصوصية من قبل DRIT تقترب 100٪ مع النتائج مقارنة مع DFA. منذ عام 2005، قام برنامج خدمات الحياة البرية التابع لوزارة الزراعة في الولايات المتحدة بجهود معززة واسعة النطاق لمراقبة داء الكلب باستخدام DRIT لاختبار > 94,000 عينة تم جمعها من الحياة البرية في مناطق إدارة داء الكلب الاستراتيجية . يوفر DRIT أداة قوية واقتصادية لتشخيص داء الكلب التي يمكن استخدامها من قبل العاملين وعلماء الأحياء الميدانية لتحسين مراقبة داء الكلب الحالي، وبرامج الوقاية والسيطرة على الصعيد العالمي.
Introduction
في حين أن DFA هو الاختبار الأكثر استخداما لتشخيص داء الكلب الروتيني1،فإن تكلفة شراء وصيانة المجهر الفلورسنت يمكن أن تكون محدودة للدول النامية2،3،4 وعلى نطاق واسع، برامج مراقبة داء الكلب على نطاق واسع3و4. وبالإضافة إلى ذلك، فإن وزارة الخارجية تتطلب القدرة على تبريد العينات أثناء التثبيت واحتضان العينات فوق درجة الحرارة المحيطة أثناء تفاعلات مستضد الأجسام المضادة، والتي يمكن أن تشكل عقبة كبيرة في البلدان التي لا توجد فيها بنية تحتية مناسبة. ويرجع ذلك جزئيا إلى القيود المرتبطة باختبارات DFA الحديثة، وقد تم التقليل من الأثر العالمي لداء الكلب منذ فترة طويلة5.
وفي هذا الصدد، هناك حاجة إلى التحقق من صحة تقنيات التشخيص الإضافية لتحسين مراقبة داء الكلب على الصعيد العالمي، ولا سيما في البلدان النامية. يوفر بروتوكول DRIT المعروض هنا بديلاً مختبرياً أو ميدانياً للاختبار على بروتوكول DFA يستخدم الفحص المجهري الخفيفولا يتطلب التبريد أو الحضانة المختبرية أثناء الاختبار 6. DRIT وDFA متشابهة في أن كلا الأسلوبين استخدام انطباعات اللمس من عينات الدماغ التي تم جمعها من الحيوانات التي يحتمل أن تكون مسعورة. ومع ذلك، فإن الخطوة الأولى من DRIT يستخدم formalin كالمثبت التاريخي للعينات، مما يعطل فيروس داء الكلب. وهذا يوفر تحسنا كبيرا في السلامة الأحيائية على الأسيتون المستخدم لإصلاح العينات في بروتوكول DFA3، وهو أمر مهم ليس فقط في المختبر ولكن ربما أكثر من ذلك في بيئات المختبر الميدانية أو اللامركزية. حتى الآن، يظهر DRIT حساسية وخصوصيةمساوية لDFA 2،7،8،9.
منذ عام 2005، قام برنامج WS التابع لوزارة الزراعة الأميركية بجهود مراقبة داء الكلب المعززة على نطاق واسع في أمريكا الشمالية باستخدام DRIT كجزء من برنامج شامل لإدارة داء الكلب البرية 10. يتم استخدام مراقبة داء الكلب المعززة كتكملة لمراقبة الصحة العامة القائمة على التعرض والاختبارات في المقام الأول أنواع الحيوانات البرية meso-carnivore، بما في ذلك الراكون(Procyon lotor)،الظربان المخطط (mephitismephitis)،الثعالب الرمادية ( Urocyon cinereoargenteus)، الثعالب الحمراء(الفرجالفرج) ، والقيوط (كانيسلاترانس)التي لم تشارك في التعرض للحيوانية البشرية أو المنزلية. وقدمت جثث الحيوانات المستخدمة في الاختبار إلى وزارة الزراعة الأمريكية WS من خلال جهود تعزيز مراقبة داء الكلب وتتألف من أنواع ناقلات داء الكلب التي هي: سوء أو غريب التمثيل; العثور على القتلى ، وقتل على الطرق ، أو مصدر إزعاج ؛ ولا ترتبط بتعرض الحيوانات البشرية أو المنزلية. يوفر DRIT اختبار تشخيص داء الكلب التي يمكن استخدامها من قبل علماء الأحياء الميدانية المدربين مع خبرة مختبرية قليلة أو معدومة لتحسين مراقبة داء الكلب والحد من العبء المالي وعبء العمل من مختبرات تشخيص الصحة العامة10. عادة ما يستغرق التدريب الأساسي لـ DRIT للموظفين الميدانيين في وزارة الزراعة الأميركية من 1.5 إلى 2 يومًا، والذي يتضمن حوالي 4 ساعات من التعليم في الفصول الدراسية الذي يغطي المبادئ الأساسية للسلامة البيولوجية، وطرق جمع العينات وعمليات DRIT، فضلاً عن >8 ساعة من وقت المختبر إجراء الاختبار. وقد أتيحت فرص التدريب لوزارة الزراعة الأميركية والمتعاونين في البرنامج من خلال مراكز مكافحة الأمراض والوقاية منها (CDC)، LYSSA LLC، ومعهد ويستار.
وفي مناطق الإدارة الاستراتيجية، قامت وزارة الزراعة الأمريكية باختبار أكثر من 94,000 عينة من الحيوانات البرية باستخدام DRIT واكتشفت أكثر من 1,850 عينة مسعورة من المرجح أن تكون قد لم يتم اكتشافها بالاعتماد فقط على اختبارات الصحة العامة للالحيوانات المشتبه فيها. تعزيز بيانات مراقبة داء الكلب التي توفرها نتائج DRIT حاسمة لتوفير تمثيل زمني ومكاني أكثر اكتمالا لداء الكلب في المناظر الطبيعية دعما لبرامج التطعيم عن طريق الفم ضد داء الكلب للحياة البرية في جميع أنحاء الولايات المتحدة الأمريكية10، 11. وبالمثل، أدرجت وكالات الحياة البرية الإقليمية في كندا DRIT في جهود مراقبة داءالكلب البري على نطاق واسع جنبا إلى جنب مع برامجها للصحة العامة بنجاح 8. وقد استخدمت كل من وزارة الزراعة الأمريكية WS والكندية DRIT برامج المراقبة المختبرات المرجعية الوطنية لتأكيد داء الكلب من قبل DFA وأداء البديل الفيروسي ة الكتابة حسب الاقتضاء8. وعلاوة على ذلك، يرسل علماء الأحياء الميدانيون التابعون لوزارة الزراعة الأمريكية 10% من العينات السلبية لتأكيد DFA إلى المختبرات المرجعية، ومنذ عام 2008، شاركوا في اختبار الكفاءة نصف السنوي لـ DRIT الذي يقدمه مختبر ولاية ويسكونسن للنظافة الصحية، كجزء من المعايير تدابير ضمان الجودة.
والهدف من هذه الطريقة هو تقديم نهج بديل لاختبار تشخيص داء الكلب الذي يمكن القيام به في المختبرات اللامركزية، في الميدان، أو في المناطق التي لا يمكن الوصول إليها بشكل روتيني إلى المجهر الإلكتروني.
Protocol
Representative Results
Discussion
وDRIT هو طريقة مرنة مناسبة للمراقبة الميدانية للكشف عن وجود فيروس داء الكلب التي يمكن استخدامها في مناطق المختبرات اللامركزية. في حين أنه من الممكن إجراء الاختبار بأكمله في بيئة ميدانية مثل على الباب الخلفي للشاحنة، فمن المثالي أن يكون هناك مساحة داخلية صغيرة مخصصة لDRIT بسبب المواد الكيميائية والمعدات وقضايا تخزين الإمدادات. بالإضافة إلى ذلك، يجب النظر في الالتزام بجميع القوانين الاتحادية وقوانين الولايات والقوانين المحلية المعمول بها، واللوائح الخاصة باستخدام المواد الكيميائية والتخلص منها. حاليا، وزارة الزراعة WS لديها 15 مرافق DRIT لاختبار عينات من 17 ولاية. يتم إنشاء مرافق وزارة الزراعة الأمريكية WS DRIT بالتعاون مع مختبرات الصحة العامة الجامعية والحكومية، في غرف مخصصة داخل مرافق أكبر وفي مقطورات مغلقة تم تعديلها وتحويلها لتكون بمثابة وحدات اختبار متنقلة في حالة الاستجابة لفاشية الطوارئ حيث اختبار مراقبة داء الكلبالمعزز مع وقت التحول الفوري أمر بالغ الأهمية (الشكل 5).
في حين أن الاختبار كان ناجحا باستخدام مادة جذع الدماغ ذات جودة متغيرة، الأنسجة الجذعية الجديدة مع عدم وجود تحلل الأنسجة هو الأمثل. كما يحدث التحلل، والجفاف، أو تسييل، وانخفاض نوعية العينة والاختبار قد الكشف عن تلطيخ أكثر غير محددة التي يمكن أن تخلط بين النتائج. هذه الملاحظة مماثلة بين DFA وDRIT2. وينبغي جمع جذع الدماغ/الجهاز العصبي المركزي في أقرب وقت ممكن ثم تخزينها مجمدة (-20 درجة مئوية) حتى الاختبار.
بشكل عام، معظم USDA WS مرافق عملية من 12 إلى 24 الشرائح في وقت واحد أثناء جلسة DRIT، بما في ذلك عنصر تحكم إيجابي واحد وعنصر تحكم سلبي واحد التي تم تأكيدها عبر DFA. وتوفر الضوابط الإيجابية والسلبية نقطة مرجعية لكل تشغيل DRIT لضمان نجاح الاختبار وللتأكد مما إذا كانت الأسئلة التفسيرية تنشأ على شرائح الاختبار. إذا لم يتم تحديد عينة أن يكون لها نتيجة إيجابية أو سلبية واضحة، يتم وصفها بأنها غير محددة واختبارها مرة ثانية من قبل DRIT. إذا لم تكن هذه العينة إيجابية أو سلبية واضحة بعد اختبارين DRIT، يتم إرسالها إلى مختبر مرجعي لDFA أو الاختبارات ذات الصلة.
كما هو الحال مع أي اختبار تشخيصي، “مشكلة اطلاق النار” مفيد مع نتائج غير متوقعة. على سبيل المثال، إذا كان تشغيل DRIT غير ناجح (أي، لا يعرض عنصر التحكم الإيجابي +3 أو +4 كثافة تلطيخ وتوزيع مستضد)، تأكد من عدم انتهاء صلاحية كافة المواد الكيميائية والكواشف. لقد وجدنا باستخدام زجاجة مفتوحة حديثا من بيروكسيد الهيدروجين في الحد الأدنى مرة واحدة في الأسبوع هو مفيد للمساعدة في منع تلطيخ غير محددة من خلال أكسدة أنسجة الدماغ. بالإضافة إلى ذلك، نوصي استبدال المخزن المؤقت خلات مرة واحدة على الأقل كل عام على الأقل، بغض النظر عن تاريخ انتهاء الصلاحية المسمى.
هناك عدد من المزايا من DRIT على DFA بما في ذلك انخفاض التكاليف، والقدرة على إجراء الاختبار خارج مختبر مركزي، والحاجة إلى مجهرية خفيفة فقط بدلا من المجهر الفلورسنت، وعملية التدريب مباشرة نسبيا ل الناس إدارة وقراءةالاختبار 2،3،4. وقد أثبتت هذه المزايا، إلى جانب حساسية وخصوصية DRIT التي يمكن مقارنتها DFA2و7و8و9 أن الاختبار بمثابة أداة هامة على نطاق واسع تعزيز برامج مراقبة داء الكلب8،10 في أمريكا الشمالية. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تسمح هذه اللجنة بزيادة المراقبة والاختبار الفوري في البلدان النامية أو في مناطق أخرى ذات موارد محدودة، لا سيما بعد التوجيهات الأخيرة التي أصدرتها منظمة الصحة العالمية/منظمة الصحة العالمية كاختبار موصى به.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نحن نعترف بجميع موظفي خدمات الحياة البرية في وزارة الزراعة الأمريكية الذين قاموا حاليًا أو سبق لهم بجمع عينات معززة لمراقبة داء الكلب وأجروا DRIT لتشخيص داء الكلب. وبالمثل، نعترف بالعديد من المتعاونين الذين يساعدوننا في جمع مراقبة داء الكلب المعزز. كما نشكر مراكز مكافحة الأمراض والوقاية منها ومعهد ويستار على إمكانية الوصول إلى الكواشف الحرجة اللازمة لإجراء عملية DRIT وعلى توفير فرص التدريب. وبالإضافة إلى ذلك، نقدر التشخيص المؤكد والمساعدة التقنية التي تقدمها مراكز مكافحة الأمراض والوقاية منها ومركز وادسوورث مع وزارة الصحة في ولاية نيويورك. استخدام أي منتجات تجارية هو لأغراض المقارنة فقط ولا يشكل تأييد.
Materials
| 3-Amino-9-Ethylcarbazole (AEC tablets; 50 count) | Sigma Aldrich (https://www.sigmaaldrich.com/) | A6926 | |
| Acetate Buffer, 0.1M, 5.2 pH, 32oz | Poly Scientific R&D Corp. (https://www.polyrnd.com/) | s140 | |
| Ag Tek MiniScalpel, PN110, Non-sterile #10, 40 per package | Patterson Veterinary (https://www.pattersonvet.com/) | PN110 | Supplemental equipment for sample touch impressions; Also available through Clipper Distributing (http://www.clipperdist.net/) |
| BD Luer-Lok Disposable Syringe without needle, 10cc | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | 14-823-2A | BD Manufacturer Number 309604 |
| Binocular Light Microscope with Seidentopf Head or equivalent | Multiple Vendors | ||
| Blue Rectangular UN-rated Disposal Container, 5G | Berlin Packaging (https://www.berlinpackaging.com/) | 1147T01BLU | Supplemental equipment for chemical waste storage/disposal (Gill hematoxylin and AEC solution) |
| Corning Square and Rectangular Cover Glass, 24×60 | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | 12-553-465 | Corning Manufacturer Number 2975246 |
| Corning Universal Fit Pipet Tips: Racked, Nonsterile (1-200ul) | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | 07-200-300 | Corning Manufacturer Number 4863 |
| Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes, polypropylene | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | 14-959-70C | Corning Manufacturer Number 352097 |
| Falcon 96-Well Assay Plates (Tissue culture plate lids) | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | 08-772-5 | Corning Manufacturer Number 353910 |
| Fisher Brand 25mm Syringe Filter, Nylon, 0.45um, Sterile | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | 09-719D | |
| Fisher Chemical Gill Method Hematoxylin Stain (Gill-2), 4L | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | CS401-1D | |
| Fisherbrand Sharps-A-Gator Point-of-Use Sharps Containers, 5qt | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | 14-827-122 | Supplemental equipment for proper BSL-2 Laboratory Set-Up |
| Fluoro-Gel with Tris Buffer (Gel/Mount Media), 20mL | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 102092-122 | Fluoro-Gel Substitute for BioMeda™ Gel-Mount, Electron Microscopy Sciences |
| Formalin, Buffered, 10%, 4L | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | SF100-4 | Available each or in case of 4 |
| Gilson Pipetman P200 Pipet, 50-200uL | Daigger Scientific (https://www.daigger.com) | EF9930E | |
| Hy-Clone Phosphate Buffered Saline, 1X Solution, 1L (PBS) | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | SH30256LS | Alternative dry powder product can be used |
| Hydrogen Peroxide, 3% | Multiple Vendors | Any commercially available source, such as pharmacy or store brands, etc. | |
| Lens Microscope Objective 20X and 40X | Multiple Vendors | ||
| Lysol IC Quarternary Disinfecting Cleaner, 1G | Daigger Scientific (https://www.daigger.com) | EF8481 | Supplemental materials for proper BSL-2 Laboratory disinfection |
| Miltex brand Disposable Scalpel Size 22 (alternative size to MiniScalpel) | AMD Next (www.amdnext.com) | 999112314 | Supplemental equipment for sample touch impressions; Alternative size to Ag Tek MiniScalpel |
| N,N-Dimethylformamide, Amber Glass Packaging, 500mL | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | D119-500 | |
| Peroxidase Labeled Streptavidin, 50mL | SeraCare (https://www.seracare.com/) | 5550-0001 | KPL Immunoassay and Kits Reference Number 71-00-38 |
| Phosphate Buffered Saline Powder (alternative to Fisher liquid PBS) | Sigma Aldrich (https://www.sigmaaldrich.com/) | P3813 | Must be prepared in 1L distilled water; Available in quantities of 1, 10 and 50 packs |
| Primary antibody: Polyclonal anti-nucleoprotein or cocktail of anti-lyssavirus biotinylated antibodies | Store at 4 degrees C | ||
| PYREX Disposable Serological Pipets, Glass, Sterile, Plugged, Corning, 1.0mL | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 7078D-1 | VWR Manufacturer Number 89091-220 |
| PYREX Disposable Serological Pipets, Glass, Sterile, Plugged, Corning, 10.0mL | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 7078D-10 | VWR Manufacturer Number 89091-106 |
| PYREX Disposable Serological Pipets, Glass, Sterile, Plugged, Corning, 5.0mL | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 7078D-5 | VWR Manufacturer Number 89091-484 |
| Richard-Allan Scientific Gills Hematoxylin Stain No. 2, 1PT (alternative to above) | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | 22-050-201 | Thermo Scientific Manufacturer Number 72504 |
| Slide Holders, 24-place | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 25608-868 | Sakura®Finetek Supplier Number 4465; Available through multiple vendors |
| Specimen Tin Boxes, 1/2oz | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 101412-452 | Supplemental equipment for storage of brain tissue samples |
| Taylor 2-Event Digital Timer/Clock | Multiple Vendors | Supplemental equipment | |
| Tissue-Tek Slide Staining Kit | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 25608-902 | Sakura®Finetek Supplier Number 4551; Available through multiple vendors |
| TWEEN 80, Polyethylene glycol, 500mL | Sigma Aldrich (https://www.sigmaaldrich.com/) | P1754 | Also available in 25mL, 1L and 1G volumes |
| VWR FLIP Pipette Filler (0.05-100mL) | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 53497-055 | |
| VWR Soft Nitrile Examination Gloves, L (100 per box) | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 89038-272 | Supplemental equipment for proper PPE |
| Water, Deionized (20L) | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 10806-022 | |
| Wheaton Clear Glass Sample Vials, 8mL | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | 06-408C | DWK Life Sciences Manufacturer Number 224884 |
| White Coated, Double Well Pattern Microscope Slides, 14mm | Tekdon Incorporated (https://www.tekdon.com/coated-microscope-slides.html) | 2-140 | |
| White Rectangular UN-rate Disposal Container, 5G | Berlin Packaging (https://www.berlinpackaging.com/) | 1147T01WHT | Supplemental equipment for chemical waste storage/disposal (Formalin) |
References
- Dean, D. J., Abelseth, M. K., Atanasiu, P., Meslin, F. X., Kaplan, M. M., Koprowski, H. . Laboratory techniques in rabies. 23, (1996).
- Durr, S., et al. Rabies diagnosis for developing countries. PLOS Neglected Tropical Diseases. 2 (3), e206 (2008).
- Rupprecht, C., et al. . Progress in the development of a direct rapid immunohistochemical test for diagnosing rabies. , (2014).
- Rupprecht, C. E., et al. Additional Progress in the Development and Application of a Direct, Rapid Immunohistochemical Test for Rabies Diagnosis. Journal of Veterinary Science. 5 (2), (2018).
- Coleman, P. G., Fevre, E. M., Cleaveland, S. Estimating the public health impact of rabies. Emerging Infectious Diseases. 10 (1), 140-142 (2004).
- . . Standard Operating Procedure for the Direct Rapid Immunohistochemistry Test (DRIT) for the detection of rabies virus antigens. , (2016).
- Lembo, T., et al. Evaluation of a direct, rapid immunohistochemical test for rabies diagnosis. Emerging Infectious Diseases. 12 (2), 310-313 (2006).
- Middel, K., Fehlner-Gardiner, C., Pulham, N., Buchanan, T. Incorporating Direct Rapid Immunohistochemical Testing into Large-Scale Wildlife Rabies Surveillance. Tropical Medicine and Infectious Disease. 2 (3), 21 (2017).
- Coetzer, A., Sabeta, C. T., Markotter, W., Rupprecht, C. E., Nel, L. H. Comparison of biotinylated monoclonal and polyclonal antibodies in an evaluation of a direct rapid immunohistochemical test for the routine diagnosis of rabies in southern Africa. PLOS Neglected Tropical Diseases. 8 (9), e3189 (2014).
- Kirby, J., et al. Enhanced Rabies Surveillance to Support Effective Oral Rabies Vaccination of Raccoons in the Eastern United States. Tropical Medicine and Infectious Disease. 2 (3), 34 (2017).
- Slate, D., et al. Oral rabies vaccination in north america: opportunities, complexities, and challenges. PLOS Neglected Tropical Diseases. 3 (12), e549 (2009).
- . Direct Rapid Immunohistochemistry Test (DRIT) protocols Available from: https://rabiessurveillanceblueprint.org/Direct-Rapid-Immunohistochemistry?lang=fr (2019)
- Khalid, A., Haque, A. . Touch Impression Cytology Versus Frozen Section as Intraoperative Consultation Diagnosis. 2, (2004).
