Meksika Cavefish işlevinde Gene manipülasyon
Summary
Evrimsel modeli sistem Astyanax mexicanusgenler manipülasyon yaklaşımları açıklar. Üç farklı teknikler açıklanmıştır: Tol2-aracılı transgenesis, CRISPR/Cas9 ve nakavt morpholinos kullanarak ifade kullanarak genom hedeflenen manipülasyon. Bu araçları doğrudan soruşturma yüzey ve mağaralarda yaşayan biçimler arasında varyasyon yatan genlerin kolaylaştıracaktır.
Abstract
Mağara hayvanlar evrimsel mekanizmaları ve göz dejenerasyon, albinizm, uyku kaybı, hyperphagia ve duyusal işleme de dahil olmak üzere çok sayıda karmaşık özellikleri değişiklikleri altta yatan genetik Üsler araştırıyor için zorlayıcı bir sistemi sağlar. Dünyanın dört bir yanından cavefish türün morfolojik ve davranışsal özelliklerin farklı mağara sistemleri arasında paylaşılan çevresel baskılar nedeniyle bir yakınsak evrim görüntüler. Çeşitli mağara tür laboratuvar ortamında inceledik. Meksika tetra, Astyanax mexicanus, kör ve görme biçimleri, karmaşık özellikleri evrimi temel biyolojik ve moleküler süreçlerini benzersiz anlayışlar sağlamıştır ve gelişmekte olan bir modeli sistemi olarak iyi hazır. Farklı biyolojik süreçlerin evrimi düzenleyen aday genler A. mexicanus tespit edilen süre, bir rol bireysel genler için doğrulamak için yeteneği sınırlandırılmış durumda. Transgenesis ve gen düzenleme teknoloji uygulanması önemli bu engeli aşmak için ve karmaşık özellikleri evrimi temel mekanizmaları incelemek için potansiyele sahiptir. Burada, A. mexicanusgen ifade değiştirmek için farklı bir metodoloji açıklayın. Morpholinos, Tol2 transgenesis, kullanımı bir yaklaşım içerir ve gen düzenleme sistemleri, yaygın olarak kullanılan Zebra balığı ve diğer balık modelleri, A. mexicanusişlevinde gen işlemek için. Bu protokollerin ayrıntılı açıklamalar için zamanlanmış üreme yordamlar, döllenmiş yumurta, iğne ve genetiği değiştirilmiş hayvanlar yelpazesi topluluğu içerir. Bu yöntembilimsel yaklaşımlar çeşitli özellikleri A. mexicanusevrimi altta yatan genetik ve sinirsel mekanizmalar incelenmesi için izin verir.
Introduction
Darwin’in Türlerin kökeni1beri bilim adamları nasıl özellikleri örümceklerle yanıt olarak tanımlanan çevre ve ekolojik baskılar, mağara organizmalar2sayesinde şeklinde içine derin anlayışlar kazandı. Nehirler boyunca Meksika ve Güney Teksas yaşayan gözlü atalarının ‘yüzey’ nüfus ve coğrafi olarak izole olasılığını en az 29: Sierra del Abra yaşayan türetilen mağara morphs Meksika tetra, A. mexicanus, oluşur ve diğer alanlarda kuzeydoğu Meksika3. Mağara ilişkili özellikleri bir dizi de dahil olmak üzere değiştirilmiş oksijen tüketimi, depigmentasyon, gözleri kaybı ve beslenme ve davranış4,5,6yiyecek arama değişmiş A. mexicanusiçinde tespit edilmiştir, 7,8,9. A. mexicanus sunar iyi tanımlanmış bir evrimsel geçmişi, ekolojik çevre detaylı karakterizasyonu ve varlığı nedeniyle yakınsak evrim mekanizmaları bağımsız soruşturma için güçlü bir model mağara gelişti nüfus10,11. Birçok göz kaybı da dahil olmak üzere cavefish içinde bulunması, kaybı uyku, beslenme, okul kaybı arttı, saldırganlık, azaltılmış ve stres yanıt azaltılmış, birden çok kez kez kullanan bağımsız kökenleri ile geliştiğini mağara kaynaklı özellikleri farklı genetik yolları arasında8,12,13,14,15mağaralar. Bu evrim A. mexicanus sistemi, güçlü bir yönüdür ve daha genel bir soru nasıl genetik sistemlerinin içgörü benzer fenotipleri oluşturmak için üzgün sağlayabilir tekrar.
Gen fonksiyonu mekanik incelenmesi için genetik teknolojisi uygulama ( A. mexicanusde dahil olmak üzere) birçok balık türlerinin sınırlı iken, Zebra balığı son gelişmeler genetik teknoloji geliştirme balık için bir temel sağlar 16,17,18,19,20. Çok sayıda araç içinde Zebra balığı gen ekspresyonu işlemek için yaygın olarak kullanılan ve bu yordamları uygulanması uzun standart hale. Örneğin, morpholino oligos (MOs) enjeksiyon tek hücreli aşamada seçerek RNA engeller ve geliştirme21,22sırasında kısa bir zamansal pencere için çeviri engeller. Buna ek olarak, yaklaşımlar, gen düzenleme gibi düzenli olarak kümelenmiş interspaced kısa palindromik yineler (CRISPR) / CRISPR ilişkili protein 9 (Cas9) ve transkripsiyon harekete geçirmek gibi efektör nükleaz (TALEN), tanımlanmış silme üretimi için izin ya da bazı durumlarda, eklemeler bir rekombinasyon genleri19,20,23,24içinde aracılığıyla. Transgenesis kararlı gen ifade veya işlev bir hücre tipi belirli şekilde işlemek için kullanılır. Tol2 sistemi transposase coinjecting tarafından Transjenik hayvanlar oluşturmak için kullanıldığı ve etkili biçimde mRNA bir transgene25,26içeren bir Tol2 DNA plazmid ile. Tol2 sistemi medaka transgenik construct17 istikrarlı germline eklemeler oluşturmak için Tol2 transposase kullanır. Tol2 transgenics üreten Tol2 entegrasyon siteleri ve mRNA ile Tol2 transposase17için çekilmiş bir transgene içeren bir plazmid coinjecting içerir. Bu sistem içinde Zebra balığı transgenik çizgiler bir dizi oluşturmak için kullanılan ve kullanımı son zamanlarda cichlidleri, killifish, stickleback de dahil olmak üzere ek acil sistemleri modellemek için genişletti ve daha yakın zamanlarda, Meksika cavefish27, 28,29,30.
Cavefish özelliği evrim elucidating mekanizmaları için büyüleyici bir biyolojik sistem olmakla birlikte, tam kapasitesini evrimsel bir model olarak tamamen harnessed değil. Bu kısmen genetik işlemek için bir yetersizlik nedeniyle olmuştur ve hücresel işlev doğrudan31. Karmaşık özellikleri düzenleyen aday genler nicel özellik loci (QTL) çalışmaları kullanarak tespit edilmiştir, ama bu aday genler doğrulanmasını zor32,33,34oldu. Son zamanlarda, morpholinos, CRISPR ve TALEN sistemleri ve Tol2kullanımı kullanarak düzenleme gen kullanarak geçici nakavt-aracılı transgenesis özellikleri35,36,37 sayısı altta yatan genetik temeli araştırmak için kullanılmıştır ,38. Uygulama ve standardizasyon bu tekniklerin gen işlev tanımlı hücre nüfus, etiketleme, manipülasyon dahil olmak üzere biyolojik özellikleri, moleküler ve sinirsel temelleri sorguya manipülasyonlar için izin verir ve fonksiyonel gazeteciler ifade. Başarılı uygulama gen veya hücresel fonksiyon işlemek için bu genetik araçların acil modeli sistemlerinde gösterdi ise detaylı iletişim kuralları hala A. mexicanusiçinde eksik.
A. mexicanus yanıt olarak değişen ortamın evrim mekanizmaları kritik içgörü sağlamak ve yeni genlerin farklı özellikleri düzenleyen tanımlamak için fırsat sunuyoruz. Bir dizi faktöre A. mexicanus kurulan genomik araçları kolayca balık laboratuvarları, büyük damızlık boy korumak yeteneği de dahil olmak üzere kurulan genetik modellerinde, mevcut uygulamak için son derece uysal bir model olduğunu gösteriyor, şeffaflık, sıralı genom ve tanımlı davranış deneyleri39. Burada, morpholinos, transgenesis ve A. mexicanusyüzey ve mağara nüfus gen düzenleme kullanımı için bir metodoloji açıklayın. A. mexicanus bu araçların daha geniş uygulama cavefish ve yüzey balık gelişimsel, fizyolojik ve davranışsal farklılıkları evrimi temel moleküler süreçleri mekanik bir soruşturma için izin verir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, morpholinos, CRISPR/Cas9 gen düzenleme ve transgenesis metodoloji kullanarak gen işlevini değiştirmek için bir metodoloji verdiğimiz. Genetik teknoloji zenginliği ve Zebra balığı bu sistem optimizasyonu büyük olasılıkla bu araçlar kolaylığı52ile transfer içine A. mexicanus sağlayacaktır. Son bulgular-si olmak kullanılmış bu yaklaşımlar A. mexicanusama bu sistem30,36,<sup class=…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Sunishka Thakur onun yardımı Genotipleme ve Şekil 2‘ de tasvir oca2 mutant balık görüntüleme için teşekkür ederiz. Bu eser Ulusal Bilim Vakfı (NSF) Ödülü 1656574 A.C.K. için NSF Ödülü 1754321 JK ve A.C.K. ve ulusal kurumları Sağlık (NIH) Ödülü R21NS105071 A.C.K. ve E.R.D. tarafından desteklenmiştir
Materials
| Fish breeding & egg supplies | |||
| Fine mesh fish net | Penn Plax | BN4 | |
| Fish tank heater | Aqueon | 100106108 | |
| Egg traps | Custom made | NA | Design and create plastic grate to place at bottom of tank to protect eggs |
| Glass pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
| Pipette bulbs | Fisher Scientific | 03-448-21 | |
| Agarose | Fisher Scientific | BP160-500 | |
| Egg molds | Adaptive Science Tools | TU-1 | |
| Morpholino supplies | |||
| Control Morpholino | Gene Tools, LLC | Standard control olio | |
| Custom Morpholino | Gene Tools, LLC | NA | |
| Phenol Red | Sigma Aldrich | P0290-100ML | |
| CRISPR supplies | |||
| Cas9 Plasmid | AddGene | 46757 | |
| GoTaq DNA Polymerase | Promega | M3001 | |
| KOD Hot Start Taq | EMD Millipore | 71-842-3 | |
| Primers | Integrated DNA Technologies | Custom | |
| T7 Megascript Kit | Ambion/Thermofisher | AM1333 | |
| miRNeasy Kit | Qiagen | 217004 | |
| mMessage mMachine T3 kit | Ambion/Thermofisher | AM1348 | |
| MinElute Kit | Qiagen | 28204 | |
| Tol2 transgenesis supplies | |||
| pCS-zT2TP plasmid | Kawakami et al., 2004 | Request from senior author | |
| CutSmart Buffer | New England Biolabs | B7204 | |
| NotI-HF Restriction Enzyme | New England Biolabs | R3189 | |
| PCR purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| SP6 mMessenger Kit | Ambion/Thermofisher | AM1340 | |
| Microinjection supplies | |||
| Glass Capillary Tubes | Sutter Instruments | BF100-58-10 | |
| Pipette puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| Picoinjector | Warner Instruments | PLI-100A | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301R | |
| Micromanipulator Stand | World Precision Instruments | M10 | |
| Micmanipulator Base | World Precision Instruments | Steel Plate Base, 10 lbs |
References
- Darwin, C. . On the Origin of Species by Means of Natural Selection. , (1859).
- Culver, D. C., Pipan, T. . The Biology of Caves and Other Subterranean Habitats. , (2009).
- Mitchell, R. W., Russell, W. H., Elliott, W. R. . Mexican Eyeless Characin Fishes, Genus Astyanax: Environment, Distribution, and Evolution. , (1977).
- Huppop, K. Oxygen consumption of Astyanax fasciatus (Characidae, Pisces): A comparison of epigean and hypogean populations. Environmental Biology of Fishes. 17, 299-308 (1986).
- Moran, D., Softley, R., Warrant, E. J. Eyeless Mexican Cavefish Save Energy by Eliminating the Circadian Rhythm in Metabolism. PLoS ONE. 9 (9), e107877 (2014).
- Protas, M. E., et al. Genetic analysis of cavefish reveals molecular convergence in the evolution of albinism. Nature genetics. 38, 107-111 (2006).
- Wall, A., Volkoff, H. Effects of fasting and feeding on the brain mRNA expressions of orexin tyrosine hydroxylase (TH), PYY and CCK in the Mexican blind cavefish (Astyanax fasciatus mexicanus). General and Comparative Endocrinology. 183, 44-52 (2013).
- Aspiras, A., Rohner, N., Marineau, B., Borowsky, R., Tabin, J. Melanocortin 4 receptor mutations contribute to the adaptation of cavefish to nutrient-poor conditions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (31), 9668-9673 (2015).
- Yoshizawa, M., Gorički, &. #. 3. 5. 2. ;., Soares, D., Jeffery, W. R. Evolution of a behavioral shift mediated by superficial neuromasts helps cavefish find food in darkness. Current Biology. 20 (18), 1631-1636 (2010).
- Jeffery, W. R. Regressive Evolution in Astyanax Cavefish. Annual Review of Genetics. 43, 25-47 (2009).
- Gross, J. B. The complex origin of Astyanax cavefish. BMC Evolutionary Biology. 12, 105 (2012).
- Elipot, Y., Hinaux, H., Callebert, J., Rétaux, S. Evolutionary shift from fighting to foraging in blind cavefish through changes in the serotonin network. Current Biology. 23 (1), 1-10 (2013).
- Kowalko, J. E. J., et al. Loss of schooling behavior in cavefish through sight-dependent and sight-independent mechanisms. Current Biology. 23 (19), 1874-1883 (2013).
- Duboué, E. R. E. R., Keene, A. C. A. C., Borowsky, R. L. R. L. Evolutionary convergence on sleep loss in cavefish populations. Current Biology. 21 (8), 671-676 (2011).
- Chin, J. S., et al. Convergence on reduced stress behavior in the Mexican blind cavefish. Developmental Biology. , (2018).
- Scheer, N., Campos-Ortega, J. A. Use of the Gal4-UAS technique for targeted gene expression in the zebrafish. Mechanisms of Development. 80 (2), 153-158 (1999).
- Kawakami, K., Shima, A., Kawakami, N. Identification of a functional transposase of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish, and its transposition in the zebrafish germ lineage. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (21), 11403-11408 (2000).
- Balciunas, D., et al. Enhancer trapping in zebrafish using the Sleeping Beauty transposon. BMC Genomics. , (2004).
- Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair. Genome Research. 24 (1), 142-153 (2014).
- Kimura, Y., Hisano, Y., Kawahara, A., Higashijima, S. I. Efficient generation of knock-in transgenic zebrafish carrying reporter/driver genes by CRISPR/Cas9-mediated genome engineering. Scientific Reports. 4, (2014).
- Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. A Primer for Morpholino Use in Zebrafish. Zebrafish. 6 (1), 69-77 (2009).
- Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene “knockdown” in zebrafish. Nature Genetics. , (2000).
- Sander, J. D., et al. Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs. Nature Biotechnology. , (2011).
- Huang, P., et al. Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs. Nature Biotechnology. , (2011).
- Kawakami, K. Transposon tools and methods in zebrafish. Developmental Dynamics. 234 (2), 244-254 (2005).
- Urasaki, A., Morvan, G., Kawakami, K. Functional dissection of the Tol2 transposable element identified the minimal cis-sequence and a highly repetitive sequence in the subterminal region essential for transposition. Genetics. 174 (2), 639-649 (2006).
- Juntti, S. A., Hu, C. K., Fernald, R. D. Tol2-Mediated Generation of a Transgenic Haplochromine Cichlid, Astatotilapia burtoni. PLoS ONE. 8 (10), (2013).
- Harel, I., Valenzano, D. R., Brunet, A. Efficient genome engineering approaches for the short-lived African turquoise killifish. Nature Protocols. 11 (10), 2010-2028 (2016).
- Erickson, P. A., Ellis, N. A., Miller, C. T. Microinjection for Transgenesis and Genome Editing in Threespine Sticklebacks. Journal of Visualized Experiments. (111), e54055 (2016).
- Elipot, Y., Legendre, L., Père, S., Sohm, F., Rétaux, S. Astyanax transgenesis and husbandry: how cavefish enters the laboratory. Zebrafish. 11 (4), 291-299 (2014).
- Keene, A., Yoshizawa, M., McGaugh, S. . Biology and Evolution of the Mexican Cavefish. , (2015).
- Casane, D., Rétaux, S. Evolutionary Genetics of the Cavefish Astyanax mexicanus. Advances in Genetics. 95, 117-159 (2016).
- Mcgaugh, S., et al. The cavefish genome reveals candidate genes for eye loss. Nature Communications. 5, 5307 (2014).
- Yoshizawa, M., et al. Distinct genetic architecture underlies the emergence of sleep loss and prey-seeking behavior in the Mexican cavefish. BMC Biology. 13 (1), (2015).
- Ma, L., Jeffery, W. R., Essner, J. J., Kowalko, J. E. Genome editing using TALENs in blind Mexican cavefish, Astyanax mexicanus. PLoS ONE. 10 (3), (2015).
- Bilandzija, H., Ma, L., Parkhurst, A., Jeffery, W. A potential benefit of albinism in Astyanax cavefish: downregulation of the oca2 gene increases tyrosine and catecholamine levels as an alternative to melanin synthesis. PLoS ONE. 8 (11), e80823 (2013).
- Alie, A., et al. Developmental evolution of the forebrain in cavefish: from natural variations in neuropeptides to behavior. eLife. 7, e32808 (2018).
- Jaggard, J. B., et al. Hypocretin underlies the evolution of sleep loss in the Mexican cavefish. eLife. 7, e32637 (2018).
- Borowsky, R. Handling Astyanax mexicanus eggs and fry. Cold Spring Harbor Protocols. 3 (11), (2008).
- Varshney, G. K., Sood, R., Burgess, S. M. Understanding and Editing the Zebrafish Genome. Advances in Genetics. 92, 1-52 (2015).
- Wierson, W. A., et al. GeneWeld: a method for efficient targeted integration directed by short homology. BioRxiv. , (2018).
- Klaassen, H., Wang, Y., Adamski, K., Rohner, N., Kowalko, J. E. CRISPR mutagenesis confirms the role of oca2 in melanin pigmentation in Astyanax mexicanus. Developmental Biology. , (2018).
- Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (34), 13904-13909 (2013).
- Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: A multisite gateway-based construction Kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).
- Kawakami, K., et al. A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish. Developmental Cell. 7 (1), 133-144 (2004).
- Kowalko, J., Ma, L., Jeffery, W. Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases (TALENs). Journal of Visualized Experiments. (112), e54113 (2016).
- Nishino, S., Ripley, B., Overeem, S., Lammers, G. J., Mignot, E. Hypocretin (orexin) deficiency in human narcolepsy. Lancet. , (2000).
- Lin, L., et al. The sleep disorder canine narcolepsy is caused by a mutation in the hypocretin (orexin) receptor 2. Cell. , (1999).
- Park, H. C., et al. Analysis of upstream elements in the HuC promoter leads to the establishment of transgenic Zebrafish with fluorescent neurons. Developmental Biology. 227 (2), 279-293 (2000).
- Higashijima, S., Masino, M. A., Mandel, G., Fetcho, J. R. Imaging Neuronal Activity During Zebrafish Behavior With a Genetically Encoded Calcium Indicator. Journal of Neurophysiology. , (2003).
- Vladimirov, N., et al. Light-sheet functional imaging in fictively behaving zebrafish. Nature Methods. 11 (9), 883-884 (2014).
- Halpern, M. E., et al. Gal4/UAS transgenic tools and their application to zebrafish. Zebrafish. 5 (2), 97-110 (2008).
- Jaggard, J. B., Stahl, B. A., Lloyd, E., Prober, D. A., Duboue, E. R., Keene, A. C. Hypocretin underlies the evolution of sleep loss in the Mexican cavefish. bioRxiv. 7, e32637 (2018).
- Bedell, V. M., Westcot, S. E., Ekker, S. C. Lessons from morpholino-based screening in zebrafish. Briefings in Functional Genomics. , (2011).
- Robu, M. E., et al. p53 activation by knockdown technologies. PLoS Genetics. , (2007).
- Hisano, Y., et al. Precise in-frame integration of exogenous DNA mediated by CRISPR/Cas9 system in zebrafish. Scientific reports. 5, 8841 (2015).
- Prykhozhij, S., et al. Optimized knock-in of point mutations in zebrafish using CRISPR/Cas9. Nucleic Acids Res. 46 (17), (2018).
- Tessadori, F., et al. Effective CRISPR/Cas9-based nucleotide editing in zebrafish to model human genetic cardiovascular disorders. Disease Model Mechanisms. 11 (10), (2018).
- Armstrong, G., Liao, M., You, Z., Lissouba, A., Chen, B., Drapeau, P. Homology Directed Knockin of Point Mutations in the Zebrafish tardbp and fus Genes in ALS Using the CRISPR/Cas9 System. PLoS ONE. 11 (3), (2016).
- Friedrich, R. W., Jacobson, G. A., Zhu, P. Circuit Neuroscience in Zebrafish. Current Biology. 20 (8), (2010).
- Friedrich, R. W., Genoud, C., Wanner, A. A. Analyzing the structure and function of neuronal circuits in zebrafish. Frontiers in Neural Circuits. 7, (2013).
- Scott, E. K., et al. Targeting neural circuitry in zebrafish using GAL4 enhancer trapping. Nature Methods. 4 (4), 323-326 (2007).
- Asakawa, K., Kawakami, K. Targeted gene expression by the Gal4-UAS system in zebrafish. Development Growth and Differentiation. , (2008).
- Lloyd, E., et al. Evolutionary shift towards lateral line dependent prey capture behavior in the blind Mexican cavefish. Developmental Biology. , (2018).
