Manipulación de la función del Gene en mexicano Cavefish

Desde el Origen de las especiesde Darwin¹, los científicos han adquirido profundas penetraciones en cómo están formados evolutivamente rasgos frente a las presiones ambientales y ecológicas definidas, gracias a la cueva de organismos². El tetra mexicano, a. mexicanus, se compone de ojos ancestrales poblaciones ‘superficiales’ que habitan en ríos en México y sur de Texas y de al menos 29 poblaciones geográficamente aisladas de morfos derivados cueva que habitan en la Sierra del Abra y otras áreas del noreste de México³. Se han identificado una serie de rasgos asociados de cueva en a. mexicanus, incluyendo consumo alterado de oxígeno, despigmentación, pérdida de ojos y alteraciones de la alimentación y forraje comportamiento^{4,5,6, 7,8,9}. A. mexicanus presenta un potente modelo para investigar mecanismos de evolución convergente debido a una historia evolutiva bien definida, una detallada caracterización del ambiente ecológico y la presencia de manera independiente desarrolló cueva las poblaciones de^10,11. Muchos de los rasgos derivados de cueva que están presentes en cavefish, incluyendo la pérdida del ojo, pérdida de sueño, mayor alimentación, pérdida de la escolaridad, reducción la agresión y reducción las respuestas de estrés, han evolucionado varias veces a través de orígenes independientes, a menudo utilizando diferentes vías genéticas entre cuevas^{8,12,13,14,15}. Esto repite la evolución es un aspecto de gran alcance del sistema a. mexicanus y puede proporcionar la penetración en la cuestión más general de sistemas como genéticos puede ser perturbado para generar fenotipos similares.

Mientras que la aplicación de la tecnología genética para la investigación mecanicista de la función del gene ha sido limitada en muchas especies de peces (incluyendo a. mexicanus), avances recientes en el pez cebra proporcionan una base para el desarrollo de la tecnología genética en peces ¹⁶,¹⁷,¹⁸,^19,20. Numerosas herramientas son ampliamente utilizados en el pez cebra para manipular la expresión genética, y la aplicación de estos procedimientos se han estandarizado mucho. Por ejemplo, la inyección de morfolino oligos (MOs) en la etapa unicelular selectivamente bloquea RNA y evita la traducción de una breve ventana temporal durante el desarrollo de^21,22. Además, enfoques gene-edición, tales como agrupadas regularmente otro corto repite palindrómico (CRISPR) / CRISPR asociados proteína 9 (Cas9) y nucleasas efectoras como activador de transcripción (TALEN), permiten la generación de las canceladuras definidas o, en algunos casos, las inserciones a través de una recombinación en el genoma^19,20,23,24. Transgénesis se usa para manipular la expresión génica estable o función de una manera específica de tipo celular. El sistema de Tol2 es utilizado con eficacia para generar animales transgénicos por coinjecting transposasa mRNA con un plásmido de DNA de Tol2 que contiene un transgen^25,26. El sistema de Tol2 utiliza la transposasa de Tol2 de medaka generar del germline estable inserciones de construct17 transgénicos. Generación de Tol2 transgénicos implica coinjecting un plásmido que contiene un transgen flanqueado por sitios de integración Tol2 y mRNA para Tol2 transposasa¹⁷. Este sistema ha sido utilizado para generar una matriz de líneas transgénicas en el pez cebra y recientemente ha ampliado su uso a los sistemas adicionales del modelo emergente, incluyendo cichlids, killis, espinoso y, más recientemente, el mexicano cavefish^{27, 28},²⁹,³⁰.

Mientras que el cavefish es un sistema biológico fascinante para desdoblamiento los mecanismos de la evolución del rasgo, su plena capacidad como un modelo evolutivo no se ha reunido completamente. Esto ha sido parcialmente debido a una incapacidad para manipular la genética y celular función directamente³¹. Se han identificado genes candidatos que regulan características complejas mediante estudios de rasgos cuantitativos loci (QTL), pero la validación de estos genes candidatos ha sido difícil³²,^33,34. Recientemente, caída transitoria usando morfolinos, gene edición utilizando sistemas CRISPR y TALEN y el uso de Tol2-transgénesis mediadas se han utilizado para investigar la base genética subyacente a una serie de rasgos³⁵,³⁶,³⁷ ,³⁸. La implementación y normalización de estas técnicas permitirá manipulaciones que interrogan las bases moleculares y neurales de rasgos biológicos, incluyendo la manipulación de la función del gene, el etiquetado de la población definida de la célula, y la expresión de los periodistas funcionales. Considerando que la implementación exitosa de estas herramientas genéticas para manipular el gen o la función celular se ha demostrado en el modelo emergente de los sistemas, protocolos detallados aún carecen de a. mexicanus.

A. mexicanus proporcionan la penetración crítica en los mecanismos de la evolución en respuesta a un entorno cambiante y presentar la oportunidad de identificar nuevos genes que regulan diversos rasgos. Varios factores sugieren que a. mexicanus es un modelo muy manejable para la aplicación de herramientas genómicas establecidas actualmente disponible en los modelos genéticos establecidos, incluyendo la habilidad de fácilmente mantener peces en los laboratorios, cría de gran tamaño, transparencia, un genoma secuenciado y ensayos de comportamiento definido³⁹. Aquí, describimos una metodología para el uso de gen edición en superficie y la cueva de las poblaciones de a. mexicanus, morfolinos y transgénesis. La aplicación más amplia de estas herramientas en a. mexicanus permitirá una investigación mecanicista de los procesos moleculares subyacentes a la evolución del desarrollo, fisiológicas y conductuales diferencias entre peces de superficie y cavefish.