Manipulatie van de genfunctie in Mexicaanse Cavefish

Sinds Darwins Origin of Species¹, hebben de wetenschappers diepgaande inzichten in hoe eigenschappen evolutionair worden gevormd in reactie op bepaalde milieu- en ecologische druk, dankzij grot organismen²opgedaan. De Mexicaanse tetra, A. mexicanus, bestaat uit eyed voorouderlijke ‘oppervlak’ populaties die bewonen rivieren in Mexico en Zuid-Texas en van ten minste 29 geografisch geïsoleerde populaties van afgeleide grot morphs bevolken de Sierra del Abra en andere gebieden van Noordoost Mexico³. Een aantal grot-geassocieerde kenmerken zijn geïdentificeerd in A. mexicanus, waaronder veranderde zuurstofverbruik depigmentatie, verlies van ogen en voeding en gedrag^{4,5,6, foerageren veranderd 7,8,9}. A. mexicanus presenteert een krachtig model voor het onderzoek naar mechanismen van convergente evolutie als gevolg van een welomschreven evolutionaire geschiedenis, een gedetailleerde karakterisering van de ecologische omgeving en de aanwezigheid van onafhankelijk geëvolueerd grot populaties^10,11. Veel van de grot-afgeleide eigenschappen die aanwezig zijn in cavefish, met inbegrip van verlies van het oog verlies slapen, verhoogde voederen, verlies van scholing, agressie, verminderd en verminderd stress reacties, geëvolueerd zijn meerdere malen door onafhankelijke oorsprong, vaak met behulp van verschillende genetische routes tussen grotten^{8,12,13,14,15}. Dit herhaald evolution is een krachtige aspect van het systeem van A. mexicanus en bieden inzicht in de meer algemene kwestie van hoe genetische systemen voor het genereren van soortgelijke fenotypen kan worden verstoord.

Terwijl de toepassing van genetische technologie voor het mechanistisch onderzoek van de genfunctie heeft is beperkt in vele vissoorten (met inbegrip van A. mexicanus), vormen recente vooruitgang in de zebravis een basis voor de ontwikkeling van de genetische technologie in vis ¹⁶,¹⁷,¹⁸,^19,20. Tal van hulpmiddelen worden veel gebruikt in zebrafish te manipuleren van genexpressie en de uitvoering van deze procedures lang zijn gestandaardiseerd. Bijvoorbeeld, de injectie van morfolino oligos (MOs) stadium de eencellige selectief blokkeert RNA en voorkomt de vertaling voor een korte tijd venster tijdens ontwikkeling^21,22. Bovendien, bewerken van gene benaderingen, zoals geclusterd regelmatig korte palindromische herhaalt (CRISPR) interspaced / CRISPR-geassocieerde proteïne 9 (Cas9) en transcriptie activator-achtige effector nuclease (TALEN), toestaan voor de generatie van gedefinieerde verwijderingen of, in sommige gevallen, invoegingen door middel van een recombinatie in genomes^19,,^20,,^23,24. Transgenese wordt gebruikt voor het manipuleren van stabiele genexpressie of functie in een celtype specifieke wijze. Het Tol2 systeem effectief wordt gebruikt voor het genereren van transgene dieren door coinjecting transposase mRNA met een Tol2 DNA plasmide met een transgenic^25,26. Het Tol2 -systeem maakt gebruik van de Tol2 transposase van medaka voor het genereren van stabiele germline inlassingen uit transgene construct17. Genereren van Tol2 transgenics houdt een plasmide met een transgenic geflankeerd door Tol2 integratie sites en mRNA voor Tol2 transposase¹⁷coinjecting. Dit systeem is gebruikt voor het genereren van een matrix van transgene lijnen in de zebravis en het gebruik ervan heeft onlangs uitgebreid tot extra opkomende modelsystemen, waaronder cichliden killifish, de stekelbaars, en, meer recentelijk, de Mexicaanse cavefish^{27, 28},²⁹,³⁰.

Terwijl de cavefish een fascinerende biologische systeem voor informatief mechanismen van trait evolutie is, heeft zijn volledige vermogen als een evolutionaire model niet zijn volledig benut. Dit is gedeeltelijk te wijten aan een onvermogen om te manipuleren genetische en cellulaire functie direct³¹. Kandidaat-genen regulering van complexe eigenschappen zijn geïdentificeerd met behulp van kwantitatieve trait loci (QTL) studies, maar de validatie van deze kandidaat-genen is moeilijk³²,^33,34. Onlangs, voorbijgaande knockdown met behulp van morpholinos, gene bewerken met behulp van systemen voor CRISPR en TALEN en het gebruik van Tol2-gemedieerde Transgenese zijn gebruikt voor het onderzoeken van de genetische basis ten grondslag liggen aan een aantal eigenschappen³⁵,³⁶,³⁷ ,³⁸. De uitvoering en de standaardisatie van deze technieken zal toestaan voor manipulaties die ondervragen van de moleculaire en neurale basis van biologische eigenschappen, met inbegrip van de manipulatie van de genfunctie, de etikettering van gedefinieerde cel populaties, en de expressie van functionele verslaggevers. Overwegende dat de succesvolle tenuitvoerlegging van deze genetische hulpprogramma’s voor het manipuleren van genen of cellulaire functie is aangetoond in opkomende modelsystemen, zijn gedetailleerde protocollen nog steeds ontbreekt in A. mexicanus.

A. mexicanus kritisch inzicht geven in de mechanismen van de evolutie in antwoord op een veranderende omgeving en presenteren van de mogelijkheid om nieuwe genen regulering van diverse eigenschappen te identificeren. Een aantal factoren suggereren dat A. mexicanus een uiterst hanteerbare model is voor de toepassing van gevestigde genomic instrumentarium momenteel in gevestigde genetische modellen, inclusief de mogelijkheid om de vis in de laboratoria, groot brood formaat, gemakkelijk te onderhouden transparantie, een gesequenceerd genoom en gedefinieerde gedrags assays³⁹. Hier beschrijven we een methodologie voor het gebruik van morpholinos, Transgenese en gene bewerken in oppervlakte en grot populaties van A. mexicanus. De bredere toepassing van deze instrumenten in A. mexicanus zal zorgen voor een mechanistisch onderzoek naar de moleculaire processen die ten grondslag liggen aan de evolutie van ontwikkelingsstoornissen, fysiologische en gedragsmatige verschillen tussen cavefish en oppervlakte vissen.