メキシコの血脈遺伝子機能の操作
Summary
進化系アステュアナクス メキシコで遺伝子を操作するためのアプローチについて述べる。3 つの方法を示します: メダカ Tol2 を介した遺伝子導入、CRISPR/Cas9、および morpholinos を使用して、式のノックダウンを使用してゲノムの対象となる操作。これらのツールは、表面と洞窟の住居形態の間変化を根底にある遺伝子の直接の調査を促進するべき。
Abstract
洞窟動物は進化のメカニズムと遺伝的基盤で目の変性、白子症、睡眠不足、過食、感覚処理など、多数の複雑な特性の変化を調査するため説得力のあるシステムを提供します。世界中から毒の種は洞窟システム間共有の環境圧力のための形態および行動の特性の収斂進化を表示します。多様な種は、実験室の設定で研究されている.晴眼者と視覚障害者のフォームで、メキシコのテトラアステュアナクス メキシコ、複雑な形質の進化の基礎となる生物学的および分子プロセスのユニークな洞察を提供している、新興のモデル システムとしてふさわしい。多様な生物学的過程の進化を制御する候補遺伝子群は、A. メキシコで発見されている、しながら、個々 の遺伝子の役割を検証する機能が制限されています。遺伝子と遺伝子編集技術のアプリケーションには、この大きな障害を克服するために、複雑な形質の進化のメカニズムを調査する可能性があります。ここでは、 A. メキシコにおける遺伝子発現を操作するための別の手法について述べる。メダカ Tol2遺伝子、morpholinos の使用を組み込むし、遺伝子編集システム、頻繁に使用されるゼブラフィッシュと他の魚をモデルに、 A. メキシコで遺伝子の機能を操作します。これらのプロトコルには、タイミングの繁殖手順の詳細な説明、受精卵、注射、および遺伝子改変動物の選択のコレクションが含まれます。A. メキシコの多様な形質の進化の遺伝学的および神経メカニズムの調査のためこれらの方法論的アプローチになります。
Introduction
ダーウィンの種の起源1、以来科学者は洞窟生物2のおかげで、定義された環境および生態学的な圧力への応答では、形質が進化の過程で形づけられるに深い洞察力を得ています。メキシコのテトラ、 A. メキシコメキシコと南テキサス中の河川に生息する目の祖先 ‘表面’ 集団シエラ ・ デル ・ アブラに生息する派生洞窟モーフの少なくとも 29 の地理的に隔離された集団の構成と北東メキシコ3の他の領域。A. メキシコ、変更された酸素消費量、色素脱失、目の損失餌と採餌行動4,5,6、変更などで識別された洞窟関連形質の数 7,8,9。独立して明確に定義された進化の歴史、生態学的環境の詳細な評価との存在により収斂進化のメカニズムを調査するための強力なモデル進化洞窟A. メキシコプレゼント人口10,11。血脈、目の損失などがある、睡眠の損失、餌、スクーリングの損失の増加、侵略を減少とストレス反応を減少、独立した起源は、しばしば活用を通じて複数回を進化している洞窟の派生形質の多く様々 な遺伝的経路間8,12,13,14,15の洞窟します。これには、 A. メキシコシステムの強力な側面は、どのように遺伝的システムのより一般的な質問への洞察力は似たような表現型を生成するため、提供して進化が繰り返されます。
ゼブラフィッシュにおける最近の進歩が魚の遺伝的技術開発の基礎を提供する遺伝子の機能解明のための遺伝子の技術のアプリケーションは、多くの魚種 ( A. メキシコを含む) に限定されている、しながら16、17、18、19,20。数多くのツールは遺伝子発現を操作するゼブラフィッシュで広く使用されて、これらの手順の実装を標準化されている長い間。たとえば、単細胞段階で morpholino oligos (MOs) の噴射は選択的に RNA をブロックし、開発21,22中簡単な時間窓の変換を防ぐことができます。さらに、遺伝子編集アプローチなど定期的にクラスター化された空間短い回文繰り返し (CRISPR) CRISPR 関連タンパク質 9 (Cas9) と転写活性化因子のようなエフェクター ヌクレアーゼ (TALEN) に定義された削除の生成を可能にします。または、いくつかのケースでは、ゲノム19,20,23,24の再結合を挿入します。遺伝子は、細胞型固有の方法で安定した遺伝子発現または関数の操作に使用されます。メダカ Tol2システムを効果的に coinjecting トランスポサーゼによるトランスジェニック動物を生成する使用 transgene25,26を含んでいるメダカ Tol2 DNA プラスミッドと mRNA。メダカ Tol2システムは、安定した生殖細胞系遺伝子組換え construct17 の挿入を生成するめだかのメダカ Tol2転移を利用しています。メダカ Tol2遺伝子組み換えを生成するには、メダカ Tol2転移17メダカ Tol2統合サイトと mRNA が並ぶ遺伝子を含むプラスミドを coinjecting が含まれます。ゼブラフィッシュにおけるトランスジェニックは行の配列を生成するこのシステムを使用されているし、その使用は最近追加する創発モデル システム、シクリッド、メダカ、トゲウオなどに拡大し、もっと最近のメキシコ毒27、 28,29,30です。
血脈は形質の進化のメカニズム解明のための魅惑的な生物学的システムが、進化モデルとしてその完全な能力が完全に利用されてないです。これは部分的に遺伝子を操作することができないのためにされており、携帯機能直接31。複雑な形質を制御する候補遺伝子群は量的形質遺伝子座 (QTL) の研究を使用して識別されているが、これらの候補者の遺伝子の検証は困難な32、33,34。最近では、morpholinos、遺伝子 CRISPR と TALEN システムとメダカ Tol2の使用を使用して編集を使用して一時的なノックダウン-仲介された遺伝子の遺伝的基盤の特徴35、36、37の数を調査する使用されています。、38。定義された細胞集団の標識遺伝子機能の操作を含む、生物学的特性の分子・神経基盤の調査操作の実装とこれらの技術の標準化可能になると機能的な記者の式です。遺伝子や細胞の機能を操作するこれらの遺伝的ツールの実装を成功させる、創発モデル システムで実証されているに対し、詳細なプロトコルはまだA. メキシコに欠けています。
A. メキシコ環境の変化への応答の進化のメカニズムに重要な洞察力を提供する、多様な特徴を制御する新規遺伝子群を特定する機会を提示します。A. メキシコ研究室、ひな大型の魚を簡単に維持する能力を含む、確立された遺伝的モデルで現在利用可能な確立されたゲノム ツールの適用の非常に扱いやすいモデルである要因の数が提案します。透明性、配列されたゲノムと定義された行動アッセイ39。ここでは、morpholinos、遺伝子導入、遺伝子編集a. メキシコの表面と洞窟の集団での使用のための方法論について述べる。血脈と表層魚群の発達、生理学、行動の違いの進化の基礎となる分子プロセスに制御機構解明のためA. メキシコでこれらのツールの広範なアプリケーションになります。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、我々 は morpholinos、編集、CRISPR/Cas9 遺伝子および遺伝子導入方法論を用いた遺伝子機能を操作するための方法論を提供しました。遺伝子技術の富とゼブラフィッシュのこれらのシステムの最適化されます可能性が高い容易52 A. メキシコにこれらのツールの転送できます。最近の知見は、 A. メキシコでこれらのアプローチを使用しているが、彼らはこ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は Sunishka Thakur のジェノタイピングおよび図 2にoca2変異体の魚をイメージングで彼女の援助をありがちましょう。この作品は、国立科学財団 (NSF) 賞を受賞 1656574 A.C.K.、j. k.、A.C.K.、NSF 賞 1754321、A.C.K. と E.R.D. に国立衛生研究所 (NIH) 賞 R21NS105071 に支えられ
Materials
| Fish breeding & egg supplies | |||
| Fine mesh fish net | Penn Plax | BN4 | |
| Fish tank heater | Aqueon | 100106108 | |
| Egg traps | Custom made | NA | Design and create plastic grate to place at bottom of tank to protect eggs |
| Glass pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
| Pipette bulbs | Fisher Scientific | 03-448-21 | |
| Agarose | Fisher Scientific | BP160-500 | |
| Egg molds | Adaptive Science Tools | TU-1 | |
| Morpholino supplies | |||
| Control Morpholino | Gene Tools, LLC | Standard control olio | |
| Custom Morpholino | Gene Tools, LLC | NA | |
| Phenol Red | Sigma Aldrich | P0290-100ML | |
| CRISPR supplies | |||
| Cas9 Plasmid | AddGene | 46757 | |
| GoTaq DNA Polymerase | Promega | M3001 | |
| KOD Hot Start Taq | EMD Millipore | 71-842-3 | |
| Primers | Integrated DNA Technologies | Custom | |
| T7 Megascript Kit | Ambion/Thermofisher | AM1333 | |
| miRNeasy Kit | Qiagen | 217004 | |
| mMessage mMachine T3 kit | Ambion/Thermofisher | AM1348 | |
| MinElute Kit | Qiagen | 28204 | |
| Tol2 transgenesis supplies | |||
| pCS-zT2TP plasmid | Kawakami et al., 2004 | Request from senior author | |
| CutSmart Buffer | New England Biolabs | B7204 | |
| NotI-HF Restriction Enzyme | New England Biolabs | R3189 | |
| PCR purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| SP6 mMessenger Kit | Ambion/Thermofisher | AM1340 | |
| Microinjection supplies | |||
| Glass Capillary Tubes | Sutter Instruments | BF100-58-10 | |
| Pipette puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| Picoinjector | Warner Instruments | PLI-100A | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301R | |
| Micromanipulator Stand | World Precision Instruments | M10 | |
| Micmanipulator Base | World Precision Instruments | Steel Plate Base, 10 lbs |
References
- Darwin, C. . On the Origin of Species by Means of Natural Selection. , (1859).
- Culver, D. C., Pipan, T. . The Biology of Caves and Other Subterranean Habitats. , (2009).
- Mitchell, R. W., Russell, W. H., Elliott, W. R. . Mexican Eyeless Characin Fishes, Genus Astyanax: Environment, Distribution, and Evolution. , (1977).
- Huppop, K. Oxygen consumption of Astyanax fasciatus (Characidae, Pisces): A comparison of epigean and hypogean populations. Environmental Biology of Fishes. 17, 299-308 (1986).
- Moran, D., Softley, R., Warrant, E. J. Eyeless Mexican Cavefish Save Energy by Eliminating the Circadian Rhythm in Metabolism. PLoS ONE. 9 (9), e107877 (2014).
- Protas, M. E., et al. Genetic analysis of cavefish reveals molecular convergence in the evolution of albinism. Nature genetics. 38, 107-111 (2006).
- Wall, A., Volkoff, H. Effects of fasting and feeding on the brain mRNA expressions of orexin tyrosine hydroxylase (TH), PYY and CCK in the Mexican blind cavefish (Astyanax fasciatus mexicanus). General and Comparative Endocrinology. 183, 44-52 (2013).
- Aspiras, A., Rohner, N., Marineau, B., Borowsky, R., Tabin, J. Melanocortin 4 receptor mutations contribute to the adaptation of cavefish to nutrient-poor conditions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (31), 9668-9673 (2015).
- Yoshizawa, M., Gorički, &. #. 3. 5. 2. ;., Soares, D., Jeffery, W. R. Evolution of a behavioral shift mediated by superficial neuromasts helps cavefish find food in darkness. Current Biology. 20 (18), 1631-1636 (2010).
- Jeffery, W. R. Regressive Evolution in Astyanax Cavefish. Annual Review of Genetics. 43, 25-47 (2009).
- Gross, J. B. The complex origin of Astyanax cavefish. BMC Evolutionary Biology. 12, 105 (2012).
- Elipot, Y., Hinaux, H., Callebert, J., Rétaux, S. Evolutionary shift from fighting to foraging in blind cavefish through changes in the serotonin network. Current Biology. 23 (1), 1-10 (2013).
- Kowalko, J. E. J., et al. Loss of schooling behavior in cavefish through sight-dependent and sight-independent mechanisms. Current Biology. 23 (19), 1874-1883 (2013).
- Duboué, E. R. E. R., Keene, A. C. A. C., Borowsky, R. L. R. L. Evolutionary convergence on sleep loss in cavefish populations. Current Biology. 21 (8), 671-676 (2011).
- Chin, J. S., et al. Convergence on reduced stress behavior in the Mexican blind cavefish. Developmental Biology. , (2018).
- Scheer, N., Campos-Ortega, J. A. Use of the Gal4-UAS technique for targeted gene expression in the zebrafish. Mechanisms of Development. 80 (2), 153-158 (1999).
- Kawakami, K., Shima, A., Kawakami, N. Identification of a functional transposase of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish, and its transposition in the zebrafish germ lineage. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (21), 11403-11408 (2000).
- Balciunas, D., et al. Enhancer trapping in zebrafish using the Sleeping Beauty transposon. BMC Genomics. , (2004).
- Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair. Genome Research. 24 (1), 142-153 (2014).
- Kimura, Y., Hisano, Y., Kawahara, A., Higashijima, S. I. Efficient generation of knock-in transgenic zebrafish carrying reporter/driver genes by CRISPR/Cas9-mediated genome engineering. Scientific Reports. 4, (2014).
- Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. A Primer for Morpholino Use in Zebrafish. Zebrafish. 6 (1), 69-77 (2009).
- Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene “knockdown” in zebrafish. Nature Genetics. , (2000).
- Sander, J. D., et al. Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs. Nature Biotechnology. , (2011).
- Huang, P., et al. Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs. Nature Biotechnology. , (2011).
- Kawakami, K. Transposon tools and methods in zebrafish. Developmental Dynamics. 234 (2), 244-254 (2005).
- Urasaki, A., Morvan, G., Kawakami, K. Functional dissection of the Tol2 transposable element identified the minimal cis-sequence and a highly repetitive sequence in the subterminal region essential for transposition. Genetics. 174 (2), 639-649 (2006).
- Juntti, S. A., Hu, C. K., Fernald, R. D. Tol2-Mediated Generation of a Transgenic Haplochromine Cichlid, Astatotilapia burtoni. PLoS ONE. 8 (10), (2013).
- Harel, I., Valenzano, D. R., Brunet, A. Efficient genome engineering approaches for the short-lived African turquoise killifish. Nature Protocols. 11 (10), 2010-2028 (2016).
- Erickson, P. A., Ellis, N. A., Miller, C. T. Microinjection for Transgenesis and Genome Editing in Threespine Sticklebacks. Journal of Visualized Experiments. (111), e54055 (2016).
- Elipot, Y., Legendre, L., Père, S., Sohm, F., Rétaux, S. Astyanax transgenesis and husbandry: how cavefish enters the laboratory. Zebrafish. 11 (4), 291-299 (2014).
- Keene, A., Yoshizawa, M., McGaugh, S. . Biology and Evolution of the Mexican Cavefish. , (2015).
- Casane, D., Rétaux, S. Evolutionary Genetics of the Cavefish Astyanax mexicanus. Advances in Genetics. 95, 117-159 (2016).
- Mcgaugh, S., et al. The cavefish genome reveals candidate genes for eye loss. Nature Communications. 5, 5307 (2014).
- Yoshizawa, M., et al. Distinct genetic architecture underlies the emergence of sleep loss and prey-seeking behavior in the Mexican cavefish. BMC Biology. 13 (1), (2015).
- Ma, L., Jeffery, W. R., Essner, J. J., Kowalko, J. E. Genome editing using TALENs in blind Mexican cavefish, Astyanax mexicanus. PLoS ONE. 10 (3), (2015).
- Bilandzija, H., Ma, L., Parkhurst, A., Jeffery, W. A potential benefit of albinism in Astyanax cavefish: downregulation of the oca2 gene increases tyrosine and catecholamine levels as an alternative to melanin synthesis. PLoS ONE. 8 (11), e80823 (2013).
- Alie, A., et al. Developmental evolution of the forebrain in cavefish: from natural variations in neuropeptides to behavior. eLife. 7, e32808 (2018).
- Jaggard, J. B., et al. Hypocretin underlies the evolution of sleep loss in the Mexican cavefish. eLife. 7, e32637 (2018).
- Borowsky, R. Handling Astyanax mexicanus eggs and fry. Cold Spring Harbor Protocols. 3 (11), (2008).
- Varshney, G. K., Sood, R., Burgess, S. M. Understanding and Editing the Zebrafish Genome. Advances in Genetics. 92, 1-52 (2015).
- Wierson, W. A., et al. GeneWeld: a method for efficient targeted integration directed by short homology. BioRxiv. , (2018).
- Klaassen, H., Wang, Y., Adamski, K., Rohner, N., Kowalko, J. E. CRISPR mutagenesis confirms the role of oca2 in melanin pigmentation in Astyanax mexicanus. Developmental Biology. , (2018).
- Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (34), 13904-13909 (2013).
- Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: A multisite gateway-based construction Kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).
- Kawakami, K., et al. A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish. Developmental Cell. 7 (1), 133-144 (2004).
- Kowalko, J., Ma, L., Jeffery, W. Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases (TALENs). Journal of Visualized Experiments. (112), e54113 (2016).
- Nishino, S., Ripley, B., Overeem, S., Lammers, G. J., Mignot, E. Hypocretin (orexin) deficiency in human narcolepsy. Lancet. , (2000).
- Lin, L., et al. The sleep disorder canine narcolepsy is caused by a mutation in the hypocretin (orexin) receptor 2. Cell. , (1999).
- Park, H. C., et al. Analysis of upstream elements in the HuC promoter leads to the establishment of transgenic Zebrafish with fluorescent neurons. Developmental Biology. 227 (2), 279-293 (2000).
- Higashijima, S., Masino, M. A., Mandel, G., Fetcho, J. R. Imaging Neuronal Activity During Zebrafish Behavior With a Genetically Encoded Calcium Indicator. Journal of Neurophysiology. , (2003).
- Vladimirov, N., et al. Light-sheet functional imaging in fictively behaving zebrafish. Nature Methods. 11 (9), 883-884 (2014).
- Halpern, M. E., et al. Gal4/UAS transgenic tools and their application to zebrafish. Zebrafish. 5 (2), 97-110 (2008).
- Jaggard, J. B., Stahl, B. A., Lloyd, E., Prober, D. A., Duboue, E. R., Keene, A. C. Hypocretin underlies the evolution of sleep loss in the Mexican cavefish. bioRxiv. 7, e32637 (2018).
- Bedell, V. M., Westcot, S. E., Ekker, S. C. Lessons from morpholino-based screening in zebrafish. Briefings in Functional Genomics. , (2011).
- Robu, M. E., et al. p53 activation by knockdown technologies. PLoS Genetics. , (2007).
- Hisano, Y., et al. Precise in-frame integration of exogenous DNA mediated by CRISPR/Cas9 system in zebrafish. Scientific reports. 5, 8841 (2015).
- Prykhozhij, S., et al. Optimized knock-in of point mutations in zebrafish using CRISPR/Cas9. Nucleic Acids Res. 46 (17), (2018).
- Tessadori, F., et al. Effective CRISPR/Cas9-based nucleotide editing in zebrafish to model human genetic cardiovascular disorders. Disease Model Mechanisms. 11 (10), (2018).
- Armstrong, G., Liao, M., You, Z., Lissouba, A., Chen, B., Drapeau, P. Homology Directed Knockin of Point Mutations in the Zebrafish tardbp and fus Genes in ALS Using the CRISPR/Cas9 System. PLoS ONE. 11 (3), (2016).
- Friedrich, R. W., Jacobson, G. A., Zhu, P. Circuit Neuroscience in Zebrafish. Current Biology. 20 (8), (2010).
- Friedrich, R. W., Genoud, C., Wanner, A. A. Analyzing the structure and function of neuronal circuits in zebrafish. Frontiers in Neural Circuits. 7, (2013).
- Scott, E. K., et al. Targeting neural circuitry in zebrafish using GAL4 enhancer trapping. Nature Methods. 4 (4), 323-326 (2007).
- Asakawa, K., Kawakami, K. Targeted gene expression by the Gal4-UAS system in zebrafish. Development Growth and Differentiation. , (2008).
- Lloyd, E., et al. Evolutionary shift towards lateral line dependent prey capture behavior in the blind Mexican cavefish. Developmental Biology. , (2018).
