التلاعب بالجينات الدالة في كافيفيش المكسيكي
Summary
يمكننا وصف النهج للتلاعب بالجينات في النظام النموذجي التطوري مكسيكي أستياناكس. ويرد وصف ثلاث تقنيات مختلفة: ترانسجينيسيس Tol2 بوساطة، وتستهدف التلاعب جينوم استخدام كريسبر/Cas9، وضربه قاضية للتعبير باستخدام مورفولينوس. وينبغي تيسير هذه الأدوات التحقيق المباشر للجينات الكامنة وراء الاختلاف بين أشكال السطح والكهوف السكنية.
Abstract
الحيوانات كهف توفير نظام مقنعة للتحقيق في آليات تطورية والأسس الوراثية الكامنة وراء التغييرات في العديد من الصفات المعقدة، بما في ذلك ضمور العين، المهق، وفقدان النوم، هايبرفاجيا، وتجهيز الحسية. عرض الأنواع من كافيفيش من جميع أنحاء العالم بتطور متقاربة من الصفات المورفولوجية والسلوكية بسبب الضغوط البيئية المشتركة بين النظم المختلفة كهف. وقد درست الأنواع المتنوعة من كهف في إعداد مختبر. تترا المكسيكية، أستياناكس مكسيكي، مع أشكال المبصرين والمكفوفين، وقدمت أفكاراً فريدة من نوعها في العمليات البيولوجية والجزيئية الكامنة وراء تطور السمات المعقدة ويستعد جيدا كنظام نموذجي ناشئة. بينما تم تحديد الجينات مرشح تنظيم تطور العمليات البيولوجية المتنوعة في ألف مكسيكي، القدرة على التحقق من صحة للجينات الفردية دوراً محدودا. تطبيق ترانسجينيسيس وتكنولوجيا الجينات تحرير لديه القدرة للتغلب على هذا العائق الكبير والتحقيق الآليات الكامنة وراء تطور السمات المعقدة. وهنا يصف لنا منهجية مختلفة للتلاعب بالجينات في ألف مكسيكي. تشمل نهج استخدام مورفولينوس، ترانسجينيسيس Tol2 ، ونماذج نظم تحرير الجينات والزرد المستخدمة عادة في الأسماك الأخرى، التعامل مع وظيفة الجينات في ألف مكسيكي. تتضمن هذه البروتوكولات وصفاً مفصلاً لتربية توقيت الإجراءات، وجمع البويضات المخصبة، والحقن، واختيار الحيوانات المحورة وراثيا. سوف تسمح هذه الأساليب المنهجية لتحقيق الآليات العصبية والوراثية الكامنة وراء تطور الصفات المتنوعة في ألف مكسيكي.
Introduction
منذ داروين أصل الأنواع1، اكتسبت العلماء رؤى عميقة في كيف تتشكل السمات تقحم في الاستجابة للضغوط البيئية والإيكولوجية المحددة، وبفضل الكهف الكائنات الحية2. تترا المكسيكية، ألف مكسيكي، يتكون من العينين السكان ‘السطحية’ الأسلاف التي تسكن الأنهار في جميع أنحاء المكسيك وتكساس الجنوبية والسكان معزولة جغرافيا على الأقل 29 نقراً الكهف المشتقة التي تسكن العبرة ديل سييرا و مناطق أخرى من شمال شرق المكسيك3. قد حددت عددا من الصفات المرتبطة بكهف في مكسيكي (أ)، بما في ذلك استهلاك الأوكسجين غيرت، تصبغ، وفقدان للعيون، وغيرت تغذية وتستخدم علفاً للسلوك4،،من56، 7،،من89. ألف مكسيكي ويعرض نموذج قوي للتحقيق بشكل مستقل في آليات التطور متقاربة بسبب تاريخ تطورية محددة تحديداً جيدا، ووصف مفصل للبيئة الإيكولوجية، والوجود تطور الكهف السكان10،11. العديد من الصفات المشتقة من الكهوف التي موجودة في كافيفيش، بما في ذلك فقدان العين، النوم فقدان، زيادة التغذية وفقدان التعليم المدرسي، وخفض العدوان، وخفض الإجهاد الاستجابات، تطورت عدة مرات من خلال أصول مستقلة، وكثيراً ما تستخدم مسارات مختلفة الوراثية بين الكهوف8،،من1213،،من1415. وكرر هذا تطور جانبا قوية لنظام مكسيكي (أ) ويمكن أن توفر قد قلق أعمق لمسألة أعم من النظم الوراثية كيف لتوليد تعمل مماثلة.
في حين اقتصر تطبيق التكنولوجيا الوراثية للتحقيق آليا في وظيفة الجينات في العديد من أنواع الأسماك (بما في ذلك (أ) مكسيكي)، التقدم الذي أحرز مؤخرا في الزرد توفر أساسا لتطوير التكنولوجيا الوراثية في الأسماك 16،17،18،19،20. العديد من أدوات تستخدم على نطاق واسع في الزرد للتلاعب بالجينات، وقد تم توحيد تنفيذ هذه الإجراءات منذ فترة طويلة. على سبيل المثال، حقن morpholino أوليجوس (MOs) في مرحلة وحيدة الخلية بشكل انتقائي كتل الجيش الملكي النيبالي ويمنع الترجمة لنافذة زمنية قصيرة خلال التنمية21،22. وبالإضافة إلى ذلك، نهج تحرير الجينات، مثل تجمع بانتظام إينتيرسباسيد يكرر المتناوب قصيرة (كريسبر)/المرتبطة كريسبر البروتين 9 (Cas9) والنسخ الشبيهة بالمنشط المستجيب نوكلاس (TALEN)، التي تسمح لتوليد المعرفة الحذف أو، في بعض الحالات، عمليات الإدراج عن طريق جزئ في جينومات19،20،،من2324. يتم استخدام ترانسجينيسيس التعامل مع التعبير الجيني مستقرة أو الدالة بطريقة محددة من نوع خلية. ويستخدم النظام Tol2 فعالة لتوليد الحيوانات المحورة وراثيا عن طريق كوينجيكتينج ترانسبوساسي مرناً مع بلازميد الحمض النووي Tol2 التي تحتوي على25،التحوير26. ويستخدم نظام Tol2 ترانسبوساسي Tol2 من الميداكا لتوليد الملاحق germline مستقرة من construct17 المعدلة وراثيا. ينطوي على توليد الوراثي Tol2 كوينجيكتينج بلازميد يحتوي على التحوير محاط بمواقع التكامل Tol2 ومرناً ل Tol2 ترانسبوساسي17. وقد استخدم هذا النظام لإنشاء صفيف خطوط معدلة وراثيا في الزرد واستعماله اتسع مؤخرا لنظم نموذجية طارئة إضافية، بما في ذلك cichlids، killifish، ستيكليباك، وفي الآونة الأخيرة، كافيفيش المكسيكية27، 28,29,30.
في حين كافيفيش نظام بيولوجي رائعة لتوضيح آليات التطور سمة، قد لا تم تسخير قدرتها الكاملة كنموذج تطوري تماما. لقد كان هذا جزئيا بسبب عدم قدرة على التعامل مع الوراثية والخلوية تعمل مباشرة31. تم التعرف على الجينات مرشح تنظيم السمات المعقدة باستخدام السمات الكمية المكاني (QTL) دراسات، ولكن تم التحقق من هذه الجينات المرشحة صعبة32،33،34. في الآونة الأخيرة، ضربة قاضية عابر باستخدام مورفولينوس، الجينات تحرير باستخدام نظم كريسبر و TALEN، واستخدام Tol2-ترانسجينيسيس الوساطة قد استخدمت للتحقيق أساسا الوراثية الكامنة وراء عدد من الصفات35،36،37 ،38. تنفيذ وتوحيد هذه التقنيات تسمح بالتلاعب باستجواب الأسس الجزيئية والعصبية للصفات البيولوجية، بما في ذلك التلاعب بوظيفة الجينات، ووسم السكان خلية محددة، و التعبير عن الصحفيين الوظيفية. بينما قد ثبت التنفيذ الناجح لهذه الأدوات الجينية للتلاعب بالجينات أو وظيفة الخلوية في نظم نموذجية ناشئة، يزال يفتقر إلى بروتوكولات مفصلة في ألف مكسيكي.
ألف مكسيكي التبصير الحرجة على آليات التطور في الاستجابة لبيئة متغيرة ويقدم الفرصة لتحديد الجينات الجديدة التي تنظم مختلف الصفات. هناك عدد من العوامل تشير إلى أن ألف مكسيكي نموذجا بالغ المرونة لتطبيق المنشأة الجينوم الأدوات المتاحة حاليا في النماذج الوراثية المتبعة، بما في ذلك القدرة على بسهولة الحفاظ على الأسماك في المختبرات، كبيرة الحجم الحضنة، الشفافية وتسلسل الجينوم، وفحوصات سلوكية محددة39. وهنا يصف لنا منهجية لاستخدام مورفولينوس، ترانسجينيسيس، وتحرير الجينات في سكان سطح، وكهف مكسيكي (أ). التطبيق الأوسع نطاقا لهذه الأدوات في مكسيكي (أ) سيسمح بإجراء تحقيق آليا في العمليات الجزيئية الكامنة وراء تطور الفوارق التنموية والفسيولوجية والسلوكية بين كافيفيش والأسماك السطحية.
Protocol
Representative Results
Discussion
وهنا، قدمنا منهجية للتلاعب بالجينات دالة باستخدام مورفولينوس، وجين كريسبر/Cas9 التحرير، ومنهجية ترانسجينيسيس. يرجح أن ثروة التكنولوجيا الوراثية وتعظيم الاستفادة من هذه النظم في الزرد سيسمح بنقل هذه الأدوات إلى ألف مكسيكي مع سهولة52. النتائج الأخيرة استخدمت هذه النهج في <e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر واضعي ثاكور سونيشكا لمساعدتها في التنميط والتصوير oca2 الأسماك المسخ هو مبين في الشكل 2. وأيده هذا العمل جائزة مؤسسة العلوم الوطنية (NSF) 1656574 للكلية، وجبهة الخلاص الوطني جائزة 1754321 جي والكلية، والمعاهد الوطنية للصحة (NIH) جائزة R21NS105071 للكلية و E.R.D.
Materials
| Fish breeding & egg supplies | |||
| Fine mesh fish net | Penn Plax | BN4 | |
| Fish tank heater | Aqueon | 100106108 | |
| Egg traps | Custom made | NA | Design and create plastic grate to place at bottom of tank to protect eggs |
| Glass pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
| Pipette bulbs | Fisher Scientific | 03-448-21 | |
| Agarose | Fisher Scientific | BP160-500 | |
| Egg molds | Adaptive Science Tools | TU-1 | |
| Morpholino supplies | |||
| Control Morpholino | Gene Tools, LLC | Standard control olio | |
| Custom Morpholino | Gene Tools, LLC | NA | |
| Phenol Red | Sigma Aldrich | P0290-100ML | |
| CRISPR supplies | |||
| Cas9 Plasmid | AddGene | 46757 | |
| GoTaq DNA Polymerase | Promega | M3001 | |
| KOD Hot Start Taq | EMD Millipore | 71-842-3 | |
| Primers | Integrated DNA Technologies | Custom | |
| T7 Megascript Kit | Ambion/Thermofisher | AM1333 | |
| miRNeasy Kit | Qiagen | 217004 | |
| mMessage mMachine T3 kit | Ambion/Thermofisher | AM1348 | |
| MinElute Kit | Qiagen | 28204 | |
| Tol2 transgenesis supplies | |||
| pCS-zT2TP plasmid | Kawakami et al., 2004 | Request from senior author | |
| CutSmart Buffer | New England Biolabs | B7204 | |
| NotI-HF Restriction Enzyme | New England Biolabs | R3189 | |
| PCR purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| SP6 mMessenger Kit | Ambion/Thermofisher | AM1340 | |
| Microinjection supplies | |||
| Glass Capillary Tubes | Sutter Instruments | BF100-58-10 | |
| Pipette puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| Picoinjector | Warner Instruments | PLI-100A | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301R | |
| Micromanipulator Stand | World Precision Instruments | M10 | |
| Micmanipulator Base | World Precision Instruments | Steel Plate Base, 10 lbs |
References
- Darwin, C. . On the Origin of Species by Means of Natural Selection. , (1859).
- Culver, D. C., Pipan, T. . The Biology of Caves and Other Subterranean Habitats. , (2009).
- Mitchell, R. W., Russell, W. H., Elliott, W. R. . Mexican Eyeless Characin Fishes, Genus Astyanax: Environment, Distribution, and Evolution. , (1977).
- Huppop, K. Oxygen consumption of Astyanax fasciatus (Characidae, Pisces): A comparison of epigean and hypogean populations. Environmental Biology of Fishes. 17, 299-308 (1986).
- Moran, D., Softley, R., Warrant, E. J. Eyeless Mexican Cavefish Save Energy by Eliminating the Circadian Rhythm in Metabolism. PLoS ONE. 9 (9), e107877 (2014).
- Protas, M. E., et al. Genetic analysis of cavefish reveals molecular convergence in the evolution of albinism. Nature genetics. 38, 107-111 (2006).
- Wall, A., Volkoff, H. Effects of fasting and feeding on the brain mRNA expressions of orexin tyrosine hydroxylase (TH), PYY and CCK in the Mexican blind cavefish (Astyanax fasciatus mexicanus). General and Comparative Endocrinology. 183, 44-52 (2013).
- Aspiras, A., Rohner, N., Marineau, B., Borowsky, R., Tabin, J. Melanocortin 4 receptor mutations contribute to the adaptation of cavefish to nutrient-poor conditions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (31), 9668-9673 (2015).
- Yoshizawa, M., Gorički, &. #. 3. 5. 2. ;., Soares, D., Jeffery, W. R. Evolution of a behavioral shift mediated by superficial neuromasts helps cavefish find food in darkness. Current Biology. 20 (18), 1631-1636 (2010).
- Jeffery, W. R. Regressive Evolution in Astyanax Cavefish. Annual Review of Genetics. 43, 25-47 (2009).
- Gross, J. B. The complex origin of Astyanax cavefish. BMC Evolutionary Biology. 12, 105 (2012).
- Elipot, Y., Hinaux, H., Callebert, J., Rétaux, S. Evolutionary shift from fighting to foraging in blind cavefish through changes in the serotonin network. Current Biology. 23 (1), 1-10 (2013).
- Kowalko, J. E. J., et al. Loss of schooling behavior in cavefish through sight-dependent and sight-independent mechanisms. Current Biology. 23 (19), 1874-1883 (2013).
- Duboué, E. R. E. R., Keene, A. C. A. C., Borowsky, R. L. R. L. Evolutionary convergence on sleep loss in cavefish populations. Current Biology. 21 (8), 671-676 (2011).
- Chin, J. S., et al. Convergence on reduced stress behavior in the Mexican blind cavefish. Developmental Biology. , (2018).
- Scheer, N., Campos-Ortega, J. A. Use of the Gal4-UAS technique for targeted gene expression in the zebrafish. Mechanisms of Development. 80 (2), 153-158 (1999).
- Kawakami, K., Shima, A., Kawakami, N. Identification of a functional transposase of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish, and its transposition in the zebrafish germ lineage. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (21), 11403-11408 (2000).
- Balciunas, D., et al. Enhancer trapping in zebrafish using the Sleeping Beauty transposon. BMC Genomics. , (2004).
- Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair. Genome Research. 24 (1), 142-153 (2014).
- Kimura, Y., Hisano, Y., Kawahara, A., Higashijima, S. I. Efficient generation of knock-in transgenic zebrafish carrying reporter/driver genes by CRISPR/Cas9-mediated genome engineering. Scientific Reports. 4, (2014).
- Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. A Primer for Morpholino Use in Zebrafish. Zebrafish. 6 (1), 69-77 (2009).
- Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene “knockdown” in zebrafish. Nature Genetics. , (2000).
- Sander, J. D., et al. Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs. Nature Biotechnology. , (2011).
- Huang, P., et al. Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs. Nature Biotechnology. , (2011).
- Kawakami, K. Transposon tools and methods in zebrafish. Developmental Dynamics. 234 (2), 244-254 (2005).
- Urasaki, A., Morvan, G., Kawakami, K. Functional dissection of the Tol2 transposable element identified the minimal cis-sequence and a highly repetitive sequence in the subterminal region essential for transposition. Genetics. 174 (2), 639-649 (2006).
- Juntti, S. A., Hu, C. K., Fernald, R. D. Tol2-Mediated Generation of a Transgenic Haplochromine Cichlid, Astatotilapia burtoni. PLoS ONE. 8 (10), (2013).
- Harel, I., Valenzano, D. R., Brunet, A. Efficient genome engineering approaches for the short-lived African turquoise killifish. Nature Protocols. 11 (10), 2010-2028 (2016).
- Erickson, P. A., Ellis, N. A., Miller, C. T. Microinjection for Transgenesis and Genome Editing in Threespine Sticklebacks. Journal of Visualized Experiments. (111), e54055 (2016).
- Elipot, Y., Legendre, L., Père, S., Sohm, F., Rétaux, S. Astyanax transgenesis and husbandry: how cavefish enters the laboratory. Zebrafish. 11 (4), 291-299 (2014).
- Keene, A., Yoshizawa, M., McGaugh, S. . Biology and Evolution of the Mexican Cavefish. , (2015).
- Casane, D., Rétaux, S. Evolutionary Genetics of the Cavefish Astyanax mexicanus. Advances in Genetics. 95, 117-159 (2016).
- Mcgaugh, S., et al. The cavefish genome reveals candidate genes for eye loss. Nature Communications. 5, 5307 (2014).
- Yoshizawa, M., et al. Distinct genetic architecture underlies the emergence of sleep loss and prey-seeking behavior in the Mexican cavefish. BMC Biology. 13 (1), (2015).
- Ma, L., Jeffery, W. R., Essner, J. J., Kowalko, J. E. Genome editing using TALENs in blind Mexican cavefish, Astyanax mexicanus. PLoS ONE. 10 (3), (2015).
- Bilandzija, H., Ma, L., Parkhurst, A., Jeffery, W. A potential benefit of albinism in Astyanax cavefish: downregulation of the oca2 gene increases tyrosine and catecholamine levels as an alternative to melanin synthesis. PLoS ONE. 8 (11), e80823 (2013).
- Alie, A., et al. Developmental evolution of the forebrain in cavefish: from natural variations in neuropeptides to behavior. eLife. 7, e32808 (2018).
- Jaggard, J. B., et al. Hypocretin underlies the evolution of sleep loss in the Mexican cavefish. eLife. 7, e32637 (2018).
- Borowsky, R. Handling Astyanax mexicanus eggs and fry. Cold Spring Harbor Protocols. 3 (11), (2008).
- Varshney, G. K., Sood, R., Burgess, S. M. Understanding and Editing the Zebrafish Genome. Advances in Genetics. 92, 1-52 (2015).
- Wierson, W. A., et al. GeneWeld: a method for efficient targeted integration directed by short homology. BioRxiv. , (2018).
- Klaassen, H., Wang, Y., Adamski, K., Rohner, N., Kowalko, J. E. CRISPR mutagenesis confirms the role of oca2 in melanin pigmentation in Astyanax mexicanus. Developmental Biology. , (2018).
- Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (34), 13904-13909 (2013).
- Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: A multisite gateway-based construction Kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).
- Kawakami, K., et al. A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish. Developmental Cell. 7 (1), 133-144 (2004).
- Kowalko, J., Ma, L., Jeffery, W. Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases (TALENs). Journal of Visualized Experiments. (112), e54113 (2016).
- Nishino, S., Ripley, B., Overeem, S., Lammers, G. J., Mignot, E. Hypocretin (orexin) deficiency in human narcolepsy. Lancet. , (2000).
- Lin, L., et al. The sleep disorder canine narcolepsy is caused by a mutation in the hypocretin (orexin) receptor 2. Cell. , (1999).
- Park, H. C., et al. Analysis of upstream elements in the HuC promoter leads to the establishment of transgenic Zebrafish with fluorescent neurons. Developmental Biology. 227 (2), 279-293 (2000).
- Higashijima, S., Masino, M. A., Mandel, G., Fetcho, J. R. Imaging Neuronal Activity During Zebrafish Behavior With a Genetically Encoded Calcium Indicator. Journal of Neurophysiology. , (2003).
- Vladimirov, N., et al. Light-sheet functional imaging in fictively behaving zebrafish. Nature Methods. 11 (9), 883-884 (2014).
- Halpern, M. E., et al. Gal4/UAS transgenic tools and their application to zebrafish. Zebrafish. 5 (2), 97-110 (2008).
- Jaggard, J. B., Stahl, B. A., Lloyd, E., Prober, D. A., Duboue, E. R., Keene, A. C. Hypocretin underlies the evolution of sleep loss in the Mexican cavefish. bioRxiv. 7, e32637 (2018).
- Bedell, V. M., Westcot, S. E., Ekker, S. C. Lessons from morpholino-based screening in zebrafish. Briefings in Functional Genomics. , (2011).
- Robu, M. E., et al. p53 activation by knockdown technologies. PLoS Genetics. , (2007).
- Hisano, Y., et al. Precise in-frame integration of exogenous DNA mediated by CRISPR/Cas9 system in zebrafish. Scientific reports. 5, 8841 (2015).
- Prykhozhij, S., et al. Optimized knock-in of point mutations in zebrafish using CRISPR/Cas9. Nucleic Acids Res. 46 (17), (2018).
- Tessadori, F., et al. Effective CRISPR/Cas9-based nucleotide editing in zebrafish to model human genetic cardiovascular disorders. Disease Model Mechanisms. 11 (10), (2018).
- Armstrong, G., Liao, M., You, Z., Lissouba, A., Chen, B., Drapeau, P. Homology Directed Knockin of Point Mutations in the Zebrafish tardbp and fus Genes in ALS Using the CRISPR/Cas9 System. PLoS ONE. 11 (3), (2016).
- Friedrich, R. W., Jacobson, G. A., Zhu, P. Circuit Neuroscience in Zebrafish. Current Biology. 20 (8), (2010).
- Friedrich, R. W., Genoud, C., Wanner, A. A. Analyzing the structure and function of neuronal circuits in zebrafish. Frontiers in Neural Circuits. 7, (2013).
- Scott, E. K., et al. Targeting neural circuitry in zebrafish using GAL4 enhancer trapping. Nature Methods. 4 (4), 323-326 (2007).
- Asakawa, K., Kawakami, K. Targeted gene expression by the Gal4-UAS system in zebrafish. Development Growth and Differentiation. , (2008).
- Lloyd, E., et al. Evolutionary shift towards lateral line dependent prey capture behavior in the blind Mexican cavefish. Developmental Biology. , (2018).
