Manipulation der Genfunktion in mexikanischen Cavefish

Seit Darwins Origin of Species¹haben Wissenschaftler gewonnen tiefe Einblicke in wie Züge als Reaktion auf definierte Umwelt- und ökologischen Druck dank Höhle Organismen²evolutionär geprägt sind. Die mexikanische Tetra, A. Mexicanus, besteht aus Augen Vorfahren “Oberfläche” Populationen, die bewohnen Flüsse in ganz Mexiko und Süd-Texas und mindestens 29 geografisch isolierten Populationen von abgeleiteten Höhle Morphs bewohnen die Sierra del Abra und andere Bereiche des nordöstlichen Mexiko³. In A. Mexicanus, einschließlich der veränderten Sauerstoffverbrauch, Depigmentierung, Verlust der Augen und veränderte Ernährung und Nahrungssuche Verhalten^{4,5,6wurde eine Reihe von Höhle-assoziierten Eigenschaften ermittelt, 7,8,9}. A. Mexicanus präsentiert ein leistungsfähiges Modell für die Untersuchung von Mechanismen der konvergente Entwicklung durch eine klar definierte Evolutionsgeschichte, eine detaillierte Charakterisierung der ökologischen Umwelt und das Vorhandensein von unabhängig Höhle entwickelt Bevölkerung^10,11. Viele der Höhle-abgeleitete Merkmale, die in Cavefish, einschließlich Auge Verlust vorliegen, schlafen Verlust, erhöht, Fütterung, Verlust des Schulens, Aggression, reduziert und verringert Stressreaktionen, entstanden mehrere Male durch unabhängige Ursprünge, oft unter Verwendung verschiedenen genetischen Wege zwischen Höhlen^{8,12,13,14,15}. Dies wiederholt Evolution ist ein starker Aspekt des A. Mexicanus Systems und bieten Einblick in die allgemeinere Frage wie genetische Systeme gestört werden kann, um ähnliche Phänotypen zu generieren.

Während die Anwendung der Gentechnik für die mechanistische Untersuchung der Genfunktion in vielen Fischarten (einschließlich A. Mexicanus) begrenzt worden, bilden die jüngsten Fortschritte in der Zebrabärbling eine Grundlage für genetische Technologieentwicklung in Fisch ¹⁶,¹⁷,¹⁸,^19,20. Zahlreiche Werkzeuge sind weit verbreitet im Zebrafisch, um Genexpression zu manipulieren, und die Durchführung dieser Verfahren lange standardisiert wurden. Z. B. die Injektion von Morpholino Oligos (MOs) im Einzel-Zell-Stadium selektiv RNA blockiert und verhindert Übersetzung für einen kurzen zeitlichen Fenster während Entwicklung^21,22. Darüber hinaus bearbeiten von gen Ansätze, wie z. B. regelmäßig gruppierten dazwischen kurze palindromische Wiederholungen (CRISPR) / CRISPR-assoziierten Protein 9 (Cas9) und Transkription Aktivator-ähnliche Effektor Nuklease (TALEN), ermöglichen die Erzeugung von definierten Löschungen oder, in einigen Fällen Einfügungen durch Rekombination in Genome^19,20,23,24. Transgenese wird verwendet, um stabile Genexpression oder Funktion in einem Zelltyp spezifische Weise zu manipulieren. Das Tol2 System wird effektiv verwendet, um transgene Tiere zu erzeugen, indem coinjecting Transposase mRNA mit einem Tol2 DNA Plasmid enthält ein Transgen^25,26. Das Tol2 -System nutzt die Tol2 Transposase von Medaka, stabile Keimbahn Einfügungen von transgenen construct17 zu generieren. Generierung von Tol2 transgene beinhaltet ein Plasmid enthält ein Transgen, flankiert von Tol2 Integration Websites und mRNA für Tol2 Transposase¹⁷coinjecting. Dieses System wurde verwendet, um ein Array von transgenen Linien im Zebrafisch generieren und seine Verwendung hat vor kurzem erweitert, um zusätzliche emergent Modellsysteme, einschließlich Cichliden, Killifische, der Stichling und, in jüngerer Zeit, die mexikanische Cavefish^{27, 28},²⁹,³⁰.

Während die Cavefish eine faszinierende biologische System für erhellendes Mechanismen der Eigenschaft Evolution, hat seine volle Fähigkeit als ein evolutionäres Modell nicht voll genutzt. Dies wurde teilweise aufgrund einer Unfähigkeit, genetische Manipulation und zelluläre Funktion direkt³¹. Kandidaten-Gene regulieren komplexe Merkmale mit quantitative Trait Loci (QTL) Studien identifiziert worden, aber die Validierung dieser Kandidatengene wurde schwer³²,^33,34. Vor kurzem, transiente Zuschlag mit Morpholinos, Bearbeitung mit CRISPR und TALEN Systemen und die Verwendung von Tol2gen-vermittelten Transgenese wurden verwendet, um die genetische Basis zugrunde liegt eine Reihe von Eigenschaften³⁵,³⁶, 37^untersuchen ,³⁸. Die Implementierung und Standardisierung dieser Techniken erlaubt für Manipulationen, die molekularen und neuronalen Grundlagen biologischer Merkmale, einschließlich der Manipulation der Genfunktion, die Kennzeichnung der definierten Zellpopulationen zu verhören und der Ausdruck des funktionalen Reporter. Während die erfolgreiche Umsetzung dieser genetischen Werkzeuge zu manipulieren-gen oder zelluläre Funktion bei emergent Modellsysteme nachgewiesen wurde, fehlen detaillierte Protokolle noch in A. Mexicanus.

A. Mexicanus kritischen Einblick in die Mechanismen der Evolution als Reaktion auf ein verändertes Umfeld und präsentieren die Möglichkeit, neuartige Gene regulieren vielfältige Merkmale zu identifizieren. Eine Reihe von Faktoren legen nahe, dass A. Mexicanus ein äußerst gefügig Modell ist für die Anwendung von etablierten genomische derzeit verfügbaren Tools in etablierten genetischen Modellen, einschließlich der Möglichkeit, Fisch in den Labors Brut Größe einfach zu pflegen, Transparenz, eine sequenzierte Genom und definierten Verhaltensstörungen Assays³⁹. Hier beschreiben wir eine Methodik für die Nutzung der Morpholinos, Transgenese und gen bearbeiten in Oberfläche und Höhle Populationen von A. Mexicanus. Die breitere Anwendung dieser Werkzeuge in A. Mexicanus ermöglicht eine mechanistische Untersuchung der molekularen Prozesse zugrunde liegen die Entwicklung von Entwicklungsstörungen, physiologischen und verhaltensbezogenen Unterschiede zwischen Cavefish und Oberfläche Fischen.