Wir beschreiben ein quantitatives Echtzeit-In-vitro-Zytolyse-Assay-System zur Bewertung der Wirksamkeit von chimeric antigenen Antigen-Rezeptor-T-Zellen, die auf flüssige und solide Tumorzellen abzielen. Dieses Protokoll kann erweitert werden, um andere Immuneffektorzellen sowie Kombinationsbehandlungen zu bewerten.
Chimeric Antigen-Rezeptor (CAR) T-Zell-Therapie für Krebs hat signifikanten klinischen Nutzen für resistente und refraktäre hämatologische Malignitäten wie akute lymphatische Leukämie im Kindesalter erreicht. Derzeit wird versucht, diese vielversprechende Therapie zusätzlich zu anderen hämatologischen Krebsarten auf solide Tumoren auszudehnen. Hier beschreiben wir die Entwicklung und Produktion potenter CAR-T-Zellen, die auf Antigene mit einzigartiger oder bevorzugter Expression auf festen und flüssigen Tumorzellen abzielen. Die In-vitro-Potenz dieser CAR-T-Zellen wird dann in Echtzeit mit dem hochempfindlichen Impedanz-basierten xCELLigence-Assay ausgewertet. Insbesondere wird der Einfluss verschiedener kostenimulatorischer Signalisierungsdomänen, wie z. B. Glukokortikoid-induzierter Tumornekrosefaktorrezeptor (TNFR)-bezogenes Protein (GITR), auf die In-vitro-Potenz von CAR-T-Zellen untersucht. Dieser Bericht enthält Protokolle für: Generierung von CAR-T-Zellen für präklinische Studien mit lentiviraler Gentransduktion, Erweiterung von CAR-T-Zellen, Validierung der CAR-Expression und Ausführung und Analyse von xCELLigence-Potenztests.
In den letzten Jahren war die CAR-T-Zelltherapie einer der prominentesten Durchbrüche in der Krebsimmuntherapie bei rezidivierenden und refraktären hämatopoetischen Malignitäten. Mit den jüngsten US-Amerikanischen Die Zulassung von CD19-gerichteten CAR-T-Zellen für akute lymphoblastische Leukämie, Non-Hodgkin-Lymphom und diffuses großes B-Zell-Lymphom sowie die Bezeichnung einer bahnbrechenden Therapie für B-Zell-Reifungsantigen (BCMA) gerichtete CAR-T-Zellen für multiples Myelom, diese Technologie hat große Aufregung in der wissenschaftlichen Gemeinschaft erzeugt und zahlreiche grundlegende, angewandte und klinische Studien weltweitbefeuert. 4,5. Im Januar 2019 wurden mehr als 700 klinische Studien in der klinischen Studiendatenbank registriert (clinicaltrials.gov); etwa 450 dieser Studien standen kurz vor dem Beginn oder rekrutierten aktiv Patienten. Die meisten klinischen Studien konzentrieren sich auf hämatologische Malignitäten, und klinische Studien, die CAR-T-Zellen verwenden, die auf CD20, CD22 und BCMAs abzielen, sowie CD19, sind im Gange6,7. Während die meisten Studien autologe CAR T-Zell-Therapie verwenden, eine signifikante Anzahl von ihnen sind auch die Erforschung der Nützlichkeit der allogenen CAR T-Zellen8,9,10. Trotz vielversprechender Ergebnisse mit hämatologischen Malignitäten hat sich die Verwendung von CAR-T-Zellen zur Zielart ierung sturer Tumoren in der Klinik aus einer Vielzahl von Gründen als viel schwieriger erwiesen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf das Fehlen guter Ziele, die ausschließlich im Tumor exprimiert werden, die Heterogenität von soliden Tumoren und Tumor “Flucht”, und die Schwierigkeit, die CAR-T-Zellen beim Zugang zum Tumor Mikroumfeld haben11,12,13,14, 15. Es besteht ein kritischer Bedarf für die Entwicklung solider tumorspezifischer CAR-T-Zellen, die diese Wirksamkeitsbarrieren und das Problem der “Ziel-Off-Tumor”-Toxizität überwinden können. Während eine Vielzahl von In-vitro- und In-vivo-Ansätzen bei der Entwicklung und Erprobung von CAR-T-Zellen gerechtfertigt sind, ist ein robuster und prädiktiver In-vitro-Potenztest von primärer Bedeutung16,17.
Um die Wirksamkeit von CAR-T-Zellen zu bewerten, wurden verschiedene In-vitro-Methoden entwickelt. Im Allgemeinen können diese Potenz-Assays in zwei große Kategorien unterteilt werden, je nachdem, ob sie (i) direkt die zytolytische Aktivität von CAR-T-Zellen gegen Zieltumorzellen messen oder (ii) Ersatzmarker wie Zytokine messen, die von den CAR-T-Zellen freigesetzt werden, wenn sie die Zielzellen abtöten. Techniken, die die zytolytische Aktivität direkt messen, umfassen den Chrom-51-Freisetzungstest (CRA)18, bildgebende Assays, die die Apoptose von Zielzellen mit Fluoreszenzsonden19,20, und Flow-Zytometrie-Assays messen, die apoptotische Zielzellen erkennen21. In diesen Assays werden CAR-T-Zellen in der Regel mit Zielzellen kokultiviert, die mit radioaktiven oder fluoreszierenden Sonden vorbeschriftet wurden, gefolgt von einer entsprechenden Messung. Obwohl es wegen seiner Sensibilität seit langem als Goldstandard auf dem Feld gilt, hat die Ratingagentur einige Nachteile. Erstens ist es ein Endpunkt-Assay und liefert keine kinetischen Informationen. Zweitens müssen die Zielzellen mit Chrom-51 beschriftet werden, das dazu neigt, aus den Zellen auszulaugen und das Hintergrundrauschen deutlich zu erhöhen22. Schließlich erfordert sie angemessene Vorsichtsmaßnahmen und die Entsorgung der radioaktiven Abfälle. Alternative Assays, die Nebenprodukte der CAR-T-Zell-Interaktion mit Zielzellen als Indikation für die Wirksamkeit messen, umfassen die Quantifizierung verschiedener Zytokine, die von CAR-T-Zellen mit entweder Strömungszytometrie-basierten Methoden oder enzymgebundenen Immunsorbent-Assays freigesetzt werden. Auch hier handelt es sich um Endpunkt-Assays, die die kumulative Freisetzung der Zytokine zu einem bestimmten Zeitpunkt messen und daher nicht unbedingt die tatsächliche zytolytische Aktivität der CAR-T-Zellen widerspiegeln.
Bei der Entwicklung eines Potenz-Assays, insbesondere eines, der die Freisetzungskriterien für eine zellbasierte Therapie wie eine CAR-T-Zelle definiert, ist es entscheidend, dass der Assay minimale Manipulationen und praktische Zeit beinhaltet, da jede Interaktion eine weitere Variable ist, die berücksichtigt werden muss und die allgemeine Robustheit und Konsistenz des Assays verringern kann. Darüber hinaus ist die Interaktion von CAR-T-Zellen mit den Tumorzellen ein dynamischer Prozess, und die Bereitstellung von Informationen über diese dynamischen Wechselwirkungen, wie die Zytolyserate, ist von primärer Bedeutung für die Potenzbewertung. Unter Berücksichtigung dieser Kriterien haben wir einen etikettenfreien kinetischen Potenztest für CAR T-Zellen entwickelt, der die xCELLigence-Echtzeit-Zellanalyseplattform (RTCA) nutzt. xCELLigence verwendet spezielle Mikrotiterplatten (E-Plates), die Goldbiosensoren enthalten, die in den Boden jedes Brunnens eingebettet sind. Diese Biosensoren arbeiten entweder mit anhaftenden soliden Tumorzellen oder flüssigen Krebszellen, die mit spezifischen Antikörpern verbunden wurden, und überwachen in Echtzeit CAR T-Zell-induzierte Veränderungen der Zielzellzahl, der Zellgröße, der Zellsubstrat-Anhaftungsfestigkeit und der Zell-Zell-Wechselwirkungen (d. h. der Barrierefunktion)17,23,24,25,26,27,28. Der Workflow ist einfach und beinhaltet das einfache Aussaat der Zielzellen in die Brunnen von E-Plates, gefolgt von der Addition der CAR-T-Zellen mit unterschiedlichen Effektor-Ziel-Verhältnissen (Abbildung 1). Da die Biosensoren kontinuierlich die Lebensfähigkeit der Zielzellen überwachen, werden die Daten automatisch in Echtzeit angezeigt.
In den letzten 15 Jahren wurde der xCELLigence-Assay für die Beurteilung der Wirksamkeit von natürlichen Killerzellen (NK) Zellen, T-Zellen, CAR-T-Zellen, Checkpoint-Inhibitoren, bispezifischen Antikörpern, onkolytischen Viren und einigen Kombinationstherapien17,29,30,31,32,33,34. Kürzlich wurde der xCELLigence Potenztest für die Herstellung von T-Zell-Rezeptor (TCR)-entwickelten T-Zellen35ausgewertet. Hier berichten wir über das RTCA-System zur Bewertung der In-vitro-Potenz von CAR-T-Zellen, die auf solide Und flüssige Tumoren in klinischen Therapien abzielen.
Chimäre Antigenrezeptoren sind mehrgliedrige Proteine, die aus einem extrazellulären einkettigen variablen Fragment (scFv-Region), einer Scharnierregion, einer Transmembranregion und einer zytoplasmatischen Domäne bestehen, die aus TCR-Signaldomänen und zusätzlichen Kosten-Imulatorei-Domänen von Rezeptoren wie CD28 und OX4011,40besteht. Um sichere, selektive und effiziente CARs zu entwerfen, ist es unerlässlich, dass die verschiedenen Permutationen im Design der CARs gründlich mit In-vitro-Potenztests und schließlich Tiermodellen getestet werden. In dieser Studie haben wir ein Protokoll und einen Workflow dafür bereitgestellt, wie ein Echtzeit-In-vitro-Potenztest das Design wirksamer CARs unterstützen kann.
Bei der Gestaltung jeder Art von Potenz-Assay, insbesondere für Herstellungszwecke, ist es zwingend erforderlich, dass der Assay empfindlich, robust, konsistent und so nah am Wirkmechanismus wie möglich16,17,41sein muss. Der hier beschriebene Echtzeit-Potenztest dient dazu, die zytolytische Aktivität der CAR-T-Zelle direkt zu messen, anstatt einen Ersatzmarker wie die Zytokinfreisetzung zu verwenden. Wichtig ist, dass der Assay keine zusätzlichen Komponenten wie Farbstoffe oder Reagenzien außer der Assayplatte (E-Plate) und den empfohlenen Medien zur Aufrechterhaltung der Zellen erfordert. Darüber hinaus ist der Assay exquisit empfindlich und liefert hoch reproduzierbare Daten im Vergleich zu anderen labelbasierten Assays42,43,44. Darüber hinaus ist der xCELLigence-Assay für die Verwendung sehr niedriger Effektor-Ziel-Verhältnisse geeignet, was ideal für die Beurteilung einer spezifischen Zytolyse ist.
Um die Flexibilität und Nützlichkeit des xCELLigence-Systems zu demonstrieren, haben wir uns auf zwei Tumortypen konzentriert, nämlich Tumoren hämatologischen Ursprungs und soliden Tumoren. Um die Wirksamkeit von CD22-gerichteten CAR-T-Zellen zu beurteilen, wurden Raji-Zellen (d. h. eine B-Zell-Lymphom-Zelllinie) mit einem Anti-CD40-Antikörper an die E-Plates gebunden. Das Ankleben von Raji-Zellen an den Boden der E-Plates führt zu einem Impedanzsignal, das die Lebensfähigkeit und Anzahl der Raji-Zellen im Brunnen widerspiegelt. Nach der Zugabe von CD22-CAR T-Zellen werden die Raji-Zellen selektiv zeit- und effektorabhängig abgetötet, was zu einer zeitabhängigen Abnahme des Impedanzsignals führt. Der Rückgang der Impedanz bedeutet Zytolyse oder Verlust der Lebensfähigkeit der Raji-Zellen17. Dieser selektive Tethering-Ansatz mit Antikörpern kann auf andere flüssige Tumorzelllinien ausgedehnt werden. Eine alternative Strategie zur Verwendung von Tumorzelllinien hämatologischen Ursprungs ist die Verwendung von anhaftenden Krebszellen, die entwickelt wurden, um die Tumorantigene, wie CD19, die in HeLa-Zellen exprimiert werden, stabil auszudrücken. Der Vorteil dieses Ansatzes ist, dass die elterlichen HeLa-Zellen leicht verfügbar sind und als negative Kontrolle für spezifität verwendet werden können. Ein solcher Ansatz wurde bereits mit CHO-CD22 vs. CHO-Zellen und CHO-BCMAs vs. CHO-Zellen29validiert. Mit solchen unterschiedlichen Ansätzen können CAR T-Zell-Design und Wirksamkeit leicht getestet werden. Der xCELLigence-Assay ist von Natur aus flexibel, und die Assay-Bedingungen können angepasst werden, um die physiologischen Bedingungen maximal anzunähern.
Ein großer Vorteil des Hier beschriebenen Potenz-Assays ist, dass es sich um einen einfachen funktionellen Assay handelt, der in Verbindung mit gentechnischen Techniken verwendet werden kann, um optimale und effiziente CARs in einer Hochdurchsatz-Manier zu entwerfen. Wie hier für CAR-T-Zellen gezeigt wurde, die auf EGFR-positive Krebszellen abzielen, kann der Assay verwendet werden, um die relative Aktivität verschiedener CAR-Konstrukte/Mutanten zu bewerten. Wir haben beispielsweise gezeigt, dass die GITR-Domäne, wenn sie sich vor der CD3-Domäne befindet, eine wesentlich robustere zytolytische Aktivität anzeigt als nach der CD3-Domäne.
Obwohl es nicht perfekt mit der in vivo CAR T-Zellaktivität korreliert, wurde die In-vitro-Zytokinfreisetzung in der Vergangenheit als Maß für die Wirksamkeit von CAR T-Zellen verwendet. Obwohl der hier beschriebene xCELLigence-basierte Potenztest zur Bewertung zellbasierter Therapien während der Herstellung oder vor der Veröffentlichung für die klinische Anwendung verwendet werden kann, ist es noch nicht so, wie gut diese Ergebnisse mit der In-vivo-Wirksamkeit korrelieren. etabliert. Die In-vivo-Wirksamkeit hängt von einer Vielzahl von Faktoren und Variablen ab, die nicht innerhalb eines In-vitro-Tests rekapituliert werden können. Zu diesen Variablen gehören: Homing der CAR-T-Zellen an die Stelle des Tumors, die Stimulation und Aktivierung der CAR-T-Zelle und ihre Fähigkeit, innerhalb des Patienten fortzubestehen, und die Tumormikroumgebung. Mit weiterer Verfeinerung kann der xCELLigence-Assay einige dieser komplexen Prozesse in vitro modellieren.
Das hier vorgesehene Protokoll gilt für die meisten anhaftenden Krebszelllinien und einige der flüssigen Tumorzelllinien. Klinische Proben wie primäre Krebszellen müssen jedoch aufgrund der Komplexität der Tumortypen und -phasen weiter getestet und optimiert werden. Es ist sicherlich erwähnenswert, dass das hier beschriebene In-vitro-Potenz-Assay-System Krebszelllinien verwendet, nur um die potenzielle Aktivität der CAR-T-Zellen widerzuspiegeln. Die reale Tumorsituation im menschlichen Körper ist viel komplexer, vor allem, wenn ein solider Tumor aufgrund der dynamischen Tumorumgebung und -entwicklung ins Visier genommen wird. Daher kann sich das Ergebnis der Wirksamkeitsbewertung nicht sehr gut in die klinische Wirksamkeit der getesteten CAR-T-Zellen niederschlagen.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die vorgestellte impedanzbasierte xCELLigence-Plattform eine etikettenfreie Überwachung der Zelltötung über einen längeren Zeitraum, nämlich bis zu 10 Tage, ermöglicht. Diese Kapazität für eine so lange zeitliche Skala für die Datenerfassung unterscheidet die Technologie von anderen Assays, die derzeit verwendet werden und die die Einrichtung mehrerer experimenteller Replikationen für die Zeitpunkterfassung und mühsame Probenmanipulation erfordern. Darüber hinaus vereinfacht der minimale Signalbeitrag der Effektor-Immunzellen die Datenanalyse. Die Software kann Daten automatisch verarbeiten und nützliche Parameter wie den Prozentsatz der Zytolyse, KT50, etc. generieren. Die Technologie hat bereits eine hohe Empfindlichkeit (mit E:T-Verhältnissen von nur 1:20) und einen großen Dynamikbereich (mit E:T-Verhältnissen von 20:1 bis 1:20) gezeigt, was mit anderen Assays nicht leicht zu erreichen ist. Insgesamt sollte die Implementierung dieser Technologie eine genauere Datenanalyse auf einer höheren Durchsatzskala ermöglichen, die die Entwicklung von CAR-T-Zell-Reagenzien verbessern und das Feld in einem viel höheren Tempo voranbringen wird.
The authors have nothing to disclose.
Die Autoren danken ProMab Biotechnologies und ACEA Biosciences für die Bereitstellung der in dieser Studie verwendeten Reagenzien und Instrumente.
7-AAD | Biolegend | 420404 | |
Anti-CD40, liquid tumor killing assay kit | ACEA Biosciences | 8100005 | |
anti-human F(ab')2 | Jackson Immunoresearch laboratories. | 109-116-088 | |
APC anti-CD3 | Biolegend | 317318 | |
Assay medium RPMI1640 | life technologies.Corp | 11875-093 | |
CAR-T cell frozen solution CryostorCS10 | Stemcell technologies | #07930 | |
CAR-T cell medium from ProMab | AIM-V+300IFU/ml IL-2 | 12055-091 | |
CD3/CD28 coated microbeads, Dynabeads | Thermofisher | 11131D | |
DMEM | GElifesciences.com | SH30243.02 | |
FACS buffer | Promab made | ||
FBS | Lonza.com | 14-503F | |
HEK293FT | Thermo Fisher | R70007 | |
INFg ELISA kit | Thermo Fisher | ||
Lentiviral Packaging Mix | System Biosciences | VP100 | |
Lenti-X quantitative RT-PCR titration kit (Clontech) | Takara | 631235 | |
Promab medium for target cells | Varied with cell lines | ||
Real time Cellular Analyer | ACEA Biosciences | ||
Thermal cycler | Thermo Fisher | ||
Transduction enhance agent, Virus Transduction Enhancer (Alstem) | Transplus, Alstem | V020 | |
Transfection dilution solution, Opti-MEM | Thermo Fisher | ||
Transfection reagent, NanoFect reagent | Alstem | NF100 |