فحص فاعليه في الوقت الحقيقي للخلايا التائية لمستقبلات مستضد تشياريك التي تستهدف الخلايا السرطانية الصلبة والدموية
Summary
ونحن وصف الكمية في الوقت الحقيقي في المختبر نظام فحص التحلل الخلوي لتقييم فاعليه الخلايا التائية مستقبلات مستضد تشياريك استهداف الخلايا السرطانية السائلة والصلبة. يمكن توسيع هذا البروتوكول لتقييم الخلايا الأخرى لجهاز المناعة ، فضلا عن العلاجات المركبة.
Abstract
وقد حققت مستقبلات مستضد تشياريك (CAR) العلاج بالخلايا التائية للسرطان فائده سريريه كبيره للامراض الخبيثة الدموية المقاومة والحرارية مثل ابيضاض الدم اللمفاوي الحاد في مرحله الطفولة. ويجري حاليا بذل جهود لتوسيع نطاق هذا العلاج الواعد ليشمل الأورام الصلبة بالاضافه إلى السرطانات الدموية الأخرى. هنا ، ونحن وصف تطوير وإنتاج خلايا السيارات T قويه تستهدف مستضدات مع التعبير فريدة أو تفضيليه علي الخلايا السرطانية الصلبة والسائلة. ثم يتم تقييم قوه في المختبر من هذه الخلايا T السيارات في الوقت الحقيقي باستخدام الفحص المستندة إلى مقاومه عاليه الحساسية القائمة علي المعاوقه. علي وجه التحديد ، يتم فحص تاثير مختلف المجالات الإشارات كوستيمولاتوري ، مثل جلوكوكورتيكويد الناجمة عن عامل نخر الورم مستقبلات (tnfr)-البروتين ذات الصلة (gitr) ، علي قوه في المختبر من الخلايا T السيارات. يتضمن هذا التقرير بروتوكولات لما يلي: توليد خلايا السيارات T للدراسات الاكلينيكيه باستخدام لينتيفيرال الجينات ، وتوسيع خلايا السيارات T ، والتحقق من صحة التعبير عن السيارات ، وتشغيل وتحليل اختبارات قوه Xcelligention.
Introduction
وفي السنوات الاخيره ، كانت المعالجة بالخلايا التائية للسيارة من أبرز الاختراقات في العلاج المناعي للسرطان لانتكس والأورام الخبيثة التي تكون الدم. مع الولايات الامريكيه الاخيره أداره الغذاء والدواء (FDA) الموافقة علي خلايا السيارات CD19 الموجهة لابيضاض الدم اللمفاوي الحاد ، 4,5. في كانون الثاني/يناير من 2019 ، تم تسجيل أكثر من 700 التجارب السريرية في قاعده بيانات التجارب السريرية (clinicaltrials.gov) ؛ حوالي 450 من هذه المحاكمات كانت اما علي وشك ان تبدا أو كانت بنشاط تجنيد المرضي. تتركز معظم التجارب السريرية علي الأورام الخبيثة الدموية ، والتجارب السريرية التي تستخدم خلايا السيارات التي تستهدف CD20 ، CD22 ، و bcmas ، بالاضافه إلى CD19 ، وهي مستمرة كذلك6،7. في حين ان معظم المحاكمات تستخدم اوتوذاتيه العلاج بالخلايا التائية ، وعدد كبير منهم أيضا استكشاف فائده الخلايا التائية السيارات t8،9،10. علي الرغم من النتائج الواعدة مع الأورام الخبيثة الدموية ، 15. هناك حاجه ماسه لتطوير خلايا السيارات الصلبة الخاصة بالأورام التي يمكن التغلب علي هذه الحواجز لفعالية ومشكله “علي الهدف–قباله الورم” سميه. في حين ان العديد من النهج في المختبر وفي الجسم الحيوي له ما يبرره في تصميم واختبار خلايا السيارات T ، فان الفحص القوي والتنبئي للقوه في المختبر هو من الاهميه الاساسيه16،17.
من أجل تقييم فاعليه خلايا السيارات T ، تم تطوير طرق مختلفه في المختبر. بشكل عام ، يمكن تقسيم هذه المقايسات قوه إلى فئتين واسعه اعتمادا علي ما إذا كانت (ط) قياس مباشره النشاط لحل من خلايا السيارات t ضد الخلايا السرطانية المستهدفة ، أو (2) قياس علامات بديله مثل السايتوكينات التي يتم إصدارها من قبل خلايا السيارات t كما انها تقتل الخلايا الهدف. وتشمل التقنيات التي تقيس النشاط لحل مباشره الكروم-51 فحص الإفراج (CRA)18, الاختبارات المستندة إلى التجارب التي تقيس المبرمج من الخلايا المستهدفة باستخدام مسبارات الفلورسنت19,20, والاختبارات تدفق الخلوي التي تكشف الخلايا المستهدفة ابوتوتيك21. في هذه المقايسات ، وعاده ما تكون الخلايا T المشتركة المستزرعة مع الخلايا المستهدفة التي تم تسميتها مسبقا مع تحقيقات المشعة أو الفلورسنت ، تليها القياس المناسب. علي الرغم من انه منذ فتره طويلة تعتبر معيار الذهب في الميدان نظرا لحساسيتها ، واللجنة السويسرية لديها بعض العيوب. أولا ، هو فحص نقطه النهاية ولا يوفر معلومات حركيه. ثانيا ، يجب تسميه الخلايا المستهدفة بالكروم-51 الذي يميل إلى الارتشاح من الخلايا ويمكن ان يزيد بشكل كبير من الضوضاء الخلفية22. وأخيرا ، فانه يتطلب الاحتياطات المناسبة والتخلص من النفايات المشعة. الاختبارات البديلة ، والتي تقيس المنتجات الثانوية للتفاعل الخلوي مع الخلايا المستهدفة باعتبارها مؤشرا علي الفاعلية ، تتضمن كميات مختلفه من السايتوكينات الصادرة عن خلايا السيارات T باستخدام الطرق المستندة إلى التدفق الخلوي أو الاختبارات المناعية المرتبطة بالانزيم. مره أخرى ، وهذه هي اختبارات نقطه النهاية التي تقيس الإصدار التراكمي من السايتوكينات في نقطه زمنيه معينه ، التالي ، قد لا تعكس بالضرورة النشاط لحل الفعلي للخلايا السيارات T.
عند تطوير مقايسة القوه ، وخاصه التي تحدد معايير الإطلاق للعلاج القائم علي الخلايا مثل خليه T السيارة ، من المهم ان الفحص ينطوي علي الحد الأدنى من التلاعب والتدريب العملي علي الوقت لان كل التفاعل هو متغير آخر يحتاج إلى ان تحسب ويمكن ان تقلل من المتانة الشاملة والاتساق من الفحص. وعلاوة علي ذلك ، فان تفاعل خلايا السيارات T مع الخلايا السرطانية هو عمليه ديناميكية ، وتوفير المعلومات حول هذه التفاعلات الديناميكية ، مثل معدل التحلل الخلوي ، هو من الاهميه الاساسيه لتقييم الفعالية. مع وضع هذه المعايير في الاعتبار ، قمنا بتطوير فحص الفعالية الحركية الخالي من التسمية لخلايا السيارات T التي تستخدم نظام تحليل الخلايا في الوقت الحقيقي xCELLigence (RTCA). يستخدم xCELLigence لوحات ميكروتيتير المتخصصة (اللوحات الكترونيه) التي تحتوي علي الذهب الحيوية المضمنة في الجزء السفلي من كل بئر. سير العمل بسيط وينطوي ببساطه علي بذر الخلايا المستهدفة في الآبار من اللوحات الكترونيه ، تليها أضافه خلايا السيارات T في نسب مختلفه من المستجيب إلى الهدف (الشكل 1). وبعد ذلك ، وبما ان أجهزه الاستشعار البيولوجي تراقب باستمرار صلاحيه الخلايا المستهدفة ، فان البيانات يتم عرضها تلقائيا في الوقت الحقيقي.
343332 وفي الاونه الاخيره ، تم تقييم المقايسة الرجولية لتصنيع الخلايا التائية (TCR) التي تمت هندستهابال35. هنا نحن تقرير توظيف نظام RTCA لتقييم قوه في المختبر من خلايا السيارات T مصممه لاستهداف الأورام الصلبة والأورام السائلة في العلاجات السريرية.
Protocol
Representative Results
Discussion
مستقبلات مستضد chimeric هي البروتينات متعددة المجالات التي تتالف من جزء متغير أحاديه الخلية سلسله واحده (scfv المنطقة), منطقه مفصليه, منطقه الغشاء الغشائي, ومجال سيتوبلازمي تتالف من المجالات الإشارات TCR والمجالات كوستيمولاتوري اضافيه من مستقبلات مثل CD28 و OX4011,40. لتصميم السيارات الامنه والانتقائية والفعالة ، من الضروري ان يتم اختبار الانحرافات المختلفة في تصميم السيارات بدقه باستخدام فحوصات القوه الانبوبيه ، وفي النهاية ، نماذج حيوانيه. في هذه الدراسة ، قمنا بتوفير بروتوكول وسير عمل لكيفيه اختبار قوه في الوقت الحقيقي في المختبر يمكن ان تسترشد تصميم السيارات الفعالة.
في تصميم اي نوع من اختبار قوه ، ولا سيما لأغراض التصنيع ، فمن المحتم ان تكون حساسة وقويه ومتسقة ، وأقرب إلى اليه العمل ممكن16،17،41. تم تصميم اختبار الفعالية في الوقت الحقيقي الموصوف هنا لقياس النشاط لحل للخلية سيارة T مباشره بدلا من استخدام علامة بديله مثل الإفراج السايسيسيني. الأهم من ذلك ، فان الفحص لا يتطلب اي مكونات اضافيه مثل الاصباغ أو الكواشف بخلاف لوحه الفحص (اللوحة الكترونيه) والوسائط الموصي بها للحفاظ علي الخلايا. بالاضافه إلى ذلك ، فان الفحص حساس بشكل رائع ويوفر بيانات عاليه الاستنساخ مقارنه بالمقايسات الأخرى المستندة إلى التسمية42،43،44. وعلاوة علي ذلك ، فان فحص Xcelligenis قابل لاستخدام نسب منخفضه جدا من المستجيب إلى الهدف التي تعتبر مثاليه لتقييم تحلل الخلايا المحدد.
من أجل إظهار المرونة والفائدة من نظام اكسسيليليجانس ، وقد ركزنا علي نوعين الورم ، وهي أورام الأصل الدموي والأورام الصلبة. من أجل تقييم فاعليه خلايا السيارات الموجهة CD22 ، تم المربوطة خلايا راجي (اي خط خلايا الغدد الليمفاوية B) إلى اللوحات الكترونيه باستخدام الأجسام المضادة لCD40. الربط بين خلايا راجي إلى أسفل اللوحات الكترونيه ينتج عنه اشاره مقاومه تعكس قابليه وعدد خلايا الراجي في البئر. بعد أضافه خلايا CD22 ، يتم قتل خلايا الراجي بشكل انتقائي بطريقه تعتمد علي الوقت والأثر ، وتتوج بانخفاض يعتمد علي الوقت في اشاره المقاومة. الانخفاض في المقاومة يدل علي التحلل أو فقدان القدرة علي البقاء لخلايا الراجي17. يمكن توسيع هذا النهج الربط الانتقائي باستخدام الأجسام المضادة لخطوط الخلايا السرطانية السائلة الأخرى. استراتيجية بديله لاستخدام خطوط الخلايا السرطانية من أصل الدم هو استخدام الخلايا السرطانية الملتصقة التي تم هندستها للتعبير بثبات عن مستضدات الورم ، مثل CD19 المعرب عنها في الخلايا هيلا. وميزه هذا النهج هي ان خلايا هيلا الابويه متاحه بسهوله ويمكن استخدامها كعنصر تحكم سلبي لتحديد الخصوصية. وقد تم بالفعل التحقق من صحة مثل هذا النهج مع الخلايا CD22 vs. cho و CHO-BCMAs مقابل الخلايا تشو29. باستخدام هذه النهج المختلفة ، يمكن اختبار الخلية T-تصميم وفعالية بسهوله. الفحص [اكسسلليجونس] بالفطرة مرنه, وفحص شروط يستطيع كنت عدلت [أين وردر تو] بشكل اقصي تقريبيه [فسولوجكل] شروط.
أحد المزايا الرئيسية لفحص الفاعلية الذي وصفناه هنا هو انه فحص وظيفي بسيط ويمكن استخدامه بالتزامن مع تقنيات الهندسة الوراثية لتصميم السيارات المثلي والفعالة بطريقه عاليه الانتاجيه. كما هو موضح هنا لخلايا السيارات T مصممه لاستهداف الخلايا السرطانية الايجابيه EGFR ، يمكن استخدام الفحص لتقييم النشاط النسبي لمختلف بنيات السيارات/المسوخ. علي سبيل المثال ، أظهرنا انه عندما يكون المجال gitr المنبع من المجال CD3 فانه يظهر نشاط لحل اقوي بكثير من عندما يقع في المصب من المجال CD3.
علي الرغم من انه لا يرتبط تماما مع في الجسم الطبيعي النشاط الخلية T, في المختبر الإفراج السايسيسيني وقد استخدمت تاريخيا كمقياس للقوه الخلية T قوه. علي الرغم من ان اختبار الفاعلية القائم علي xCELLigence الموصوف هنا يمكن استخدامه لتقييم العلاجات القائمة علي الخلايا اثناء التصنيع أو قبل إصداره للتطبيقات السريرية ، فان مدي ارتباط هذه النتائج بفعالية الجسم الحيوي لم يتم بعد المنشاه. في فعاليه الجسم الحيوي يعتمد علي مجموعه من العوامل والمتغيرات التي لا يمكن تلخيصها في الفحص في المختبر. وتشمل هذه المتغيرات: الموجه من خلايا السيارات T إلى موقع الورم ، وتحفيز وتفعيل الخلية T السيارة وقدرتها علي الاستمرار داخل المريض ، والبيئة المجهرية الورم. مع مزيد من الصقل ، قد يكون فحص xCELLigence قادرا علي نمذجة بعض هذه العمليات المعقدة في المختبر.
ينطبق البروتوكول المقدم هنا علي معظم خطوط الخلايا السرطانية الملتصقة وبعض خطوط الخلايا السرطانية السائلة. العينات السريرية مثل الخلايا السرطانية الاوليه ، ومع ذلك ، تحتاج إلى مزيد من الاختبار والأمثل بسبب تعقيد أنواع ومراحل الورم. ومن المؤكد ان من الجدير بالذكر ان نظام الفحص قوه في المختبر وصفها هنا يستخدم خطوط الخلايا السرطانية فقط لتعكس النشاط المحتمل للخلايا السيارات T. الوضع الحقيقي الورم داخل جسم الإنسان هو أكثر تعقيدا بكثير ، وخصوصا عندما يتم استهداف الورم الصلبة ، وذلك بسبب بيئة الورم الديناميكية والتنمية. ولذلك ، فان نتيجة تقييم قوه قد لا تترجم بشكل جيد للغاية في الفعالية السريرية للخلايا السيارات T اختبارها.
وباختصار ، فان منصة xCELLigence المقدمة علي أساس المقاومة تسمح بالرصد الخالي من التسمية لقتل الخلايا لفتره طويلة من الزمن ، اي ما يصل إلى 10 أيام. وهذه القدرة علي هذا النطاق الزمني الطويل لجمع البيانات تفرق بين التكنولوجيا والمقايسات الأخرى المستخدمة حاليا والتي تتطلب اعداد نسخ متماثلة تجريبية متعددة لجمع النقاط الزمنيه والتلاعب بالعينات المضنية. وعلاوة علي ذلك ، فان الحد الأدنى من مساهمه الخلايا المناعية المستجيبة يبسط تحليل البيانات. يمكن للبرنامج معالجه البيانات تلقائيا وتوليد المعلمات المفيدة مثل النسبة المئوية للسيتولسيس ، KT50 ، الخ. وقد أظهرت التكنولوجيا بالفعل حساسية عاليه (مع نسب E:T منخفضه مثل 1:20) ومجموعه ديناميكية كبيره (مع نسب E:T من 20:1 إلى 1:20) ، والتي لا يمكن تحقيقها بسهوله مع غيرها من المقايسات. وعموما ، فان تنفيذ هذه التكنولوجيا ينبغي ان يسمح بتحليل أكثر دقه للبيانات علي نطاق الانتاجيه العالية التي من شانها ان تعزز تطوير الكواشف الخلية تي السيارات ، والنهوض بالميدان بوتيرة اعلي بكثير.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويشكر المؤلفون ProMab التكنولوجيات الحيوية و اسيا والعلوم الحيوية لتوفير الكواشف والاداات المستخدمة في هذه الدراسة.
Materials
| 7-AAD | Biolegend | 420404 | |
| Anti-CD40, liquid tumor killing assay kit | ACEA Biosciences | 8100005 | |
| anti-human F(ab')2 | Jackson Immunoresearch laboratories. | 109-116-088 | |
| APC anti-CD3 | Biolegend | 317318 | |
| Assay medium RPMI1640 | life technologies.Corp | 11875-093 | |
| CAR-T cell frozen solution CryostorCS10 | Stemcell technologies | #07930 | |
| CAR-T cell medium from ProMab | AIM-V+300IFU/ml IL-2 | 12055-091 | |
| CD3/CD28 coated microbeads, Dynabeads | Thermofisher | 11131D | |
| DMEM | GElifesciences.com | SH30243.02 | |
| FACS buffer | Promab made | ||
| FBS | Lonza.com | 14-503F | |
| HEK293FT | Thermo Fisher | R70007 | |
| INFg ELISA kit | Thermo Fisher | ||
| Lentiviral Packaging Mix | System Biosciences | VP100 | |
| Lenti-X quantitative RT-PCR titration kit (Clontech) | Takara | 631235 | |
| Promab medium for target cells | Varied with cell lines | ||
| Real time Cellular Analyer | ACEA Biosciences | ||
| Thermal cycler | Thermo Fisher | ||
| Transduction enhance agent, Virus Transduction Enhancer (Alstem) | Transplus, Alstem | V020 | |
| Transfection dilution solution, Opti-MEM | Thermo Fisher | ||
| Transfection reagent, NanoFect reagent | Alstem | NF100 |
References
- Miliotou, A. N., Papadopoulou, L. C. CAR T-cell Therapy: A New Era in Cancer Immunotherapy. Current Pharmaceutical Biotechnology. 19 (1), 5-18 (2018).
- June, C. H., O’Connor, R. S., Kawalekar, O. U., Ghassemi, S., Milone, M. C. CAR T cell immunotherapy for human cancer. Science. 359 (6382), 1361-1365 (2018).
- . FDA approval brings first gene therapy to the United States Available from: https://www.fda.gov/NewsEvents/Newsroom/PressAnnouncements/ucm574058.htm (2017)
- . FDA approves CAR-T cell therapy to treat adults with certain types of large B-cell lymphoma Available from: https://www.fda.gov/newsevents/newsroom/pressannouncements/ucm581216.htm (2017)
- Liu, B., Song, Y., Liu, D. Clinical trials of CAR-T cells in China. Journal of Hematology & Oncology. 10 (1), 166 (2017).
- Fry, T. J., et al. CD22-targeted CAR T cells induce remission in B-ALL that is naive or resistant to CD19-targeted CAR immunotherapy. Nature Medicine. 24 (1), 20-28 (2018).
- Yang, Y., Jacoby, E., Fry, T. J. Challenges and opportunities of allogeneic donor-derived CAR T cells. Current Opinion in Hematology. 22 (6), 509-515 (2015).
- . Celyad Announces FDA Acceptance of IND Application for CYAD-101, a First-in-Class Non-Gene Edited Allogeneic CAR-T Candidate Available from: https://www.celyad.com/en/news/celyad-announces-fda-acceptance-of-ind-application-for-cyad-101-a-first-in-class-non-gene-edited-allogeneic-car-t-candidate (2017)
- Sheridan, C. Allogene and Celularity move CAR-T therapy off the shelf. Nature Biotechnology. 36 (5), 375-377 (2018).
- D’Aloia, M. M., Zizzari, I. G., Sacchetti, B., Pierelli, L., Alimandi, M. CAR-T cells: the long and winding road to solid tumors. Cell Death & Disease. 9 (3), 282 (2018).
- Xu, J., et al. Combination therapy: A feasibility strategy for CAR-T cell therapy in the treatment of solid tumors. Oncology Letters. 16 (2), 2063-2070 (2018).
- Xia, A. L., Wang, X. C., Lu, Y. J., Lu, X. J., Sun, B. Chimeric-antigen receptor T (CAR-T) cell therapy for solid tumors: challenges and opportunities. Oncotarget. 8 (52), 90521-90531 (2017).
- Yong, C. S. M., et al. CAR T-cell therapy of solid tumors. Immunology and Cell Biology. 95 (4), 356-363 (2017).
- Newick, K., O’Brien, S., Moon, E., Albelda, S. M. CAR T Cell Therapy for Solid Tumors. Annual Review of Medicine. 68, 139-152 (2017).
- de Wolf, C., van de Bovenkamp, M., Hoefnagel, M. Regulatory perspective on in vitro potency assays for human mesenchymal stromal cells used in immunotherapy. Cytotherapy. 19 (7), 784-797 (2017).
- Cerignoli, F., et al. In vitro immunotherapy potency assays using real-time cell analysis. PLOS ONE. , (2018).
- Holden, H. T., Oldham, R. K., Ortaldo, J. R., Herberman, R. B. Standardization of the chromium-51 release, cell-mediated cytotoxicity assay: cryopreservation of mouse effector and target cells. Journal of the National Cancer Institute. 58 (3), 611-622 (1977).
- Somanchi, S. S., McCulley, K. J., Somanchi, A., Chan, L. L., Lee, D. A. A Novel Method for Assessment of Natural Killer Cell Cytotoxicity Using Image Cytometry. PLOS ONE. 10 (10), e0141074 (2015).
- Mukherjee, M., Mace, E. M., Carisey, A. F., Ahmed, N., Orange, J. S. Quantitative Imaging Approaches to Study the CAR Immunological Synapse. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 25 (8), 1757-1768 (2017).
- Zaritskaya, L., Shurin, M. R., Sayers, T. J., Malyguine, A. M. New flow cytometric assays for monitoring cell-mediated cytotoxicity. Expert Review of Vaccines. 9 (6), 601-616 (2010).
- Nelson, D. L., Kurman, C. C., Serbousek, D. E. Chapter 7, Unit 7: 51Cr release assay of antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC). Current Protocols in Immunology. , 27 (2001).
- Abassi, Y. A., et al. Label-free, real-time monitoring of IgE-mediated mast cell activation on microelectronic cell sensor arrays. Journal of Immunological Methods. 292 (1-2), 195-205 (2004).
- Glamann, J., Hansen, A. J. Dynamic detection of natural killer cell-mediated cytotoxicity and cell adhesion by electrical impedance measurements. Assay and Drug Development Technologies. 4 (5), 555-563 (2006).
- Solly, K., Wang, X., Xu, X., Strulovici, B., Zheng, W. Application of real-time cell electronic sensing (RT-CES) technology to cell-based assays. Assay and Drug Development Technologies. 2 (4), 363-372 (2004).
- Zhu, J., Wang, X., Xu, X., Abassi, Y. A. Dynamic and label-free monitoring of natural killer cell cytotoxic activity using electronic cell sensor arrays. Journal of Immunological Methods. 309 (1-2), 25-33 (2006).
- Ke, N., Wang, X., Xu, X., Abassi, Y. A. The xCELLigence system for real-time and label-free monitoring of cell viability. Methods in Molecular Biology. 740, 33-43 (2011).
- Lamarche, B. J., Xi, B., Cerignoli, F. Quantifying the Potency of Cancer Immunotherapies: Immune Cell-Mediated Killing Kinetics and Efficacy Analysis in Real-Time without the Use of Labels. Genetic Engineering & Biotechnology News (GEN). 36 (14), 18-19 (2016).
- Golubovskaya, V., et al. CD47-CAR-T Cells Effectively Kill Target Cancer Cells and Block Pancreatic Tumor Growth. Cancers. 9 (10), (2017).
- Golubovskaya, V. M., et al. GITR domain inside CAR co-stimulates activity of CAR-T cells against cancer. Frontiers in Bioscience. 23, 2245-2254 (2018).
- Guedan, S., et al. Enhancing CAR T cell persistence through ICOS and 4-1BB costimulation. JCI Insight. 3 (1), (2018).
- Erskine, C. L., Henle, A. M., Knutson, K. L. Determining optimal cytotoxic activity of human Her2neu specific CD8 T cells by comparing the Cr51 release assay to the xCELLigence system. Journal of Visualized Experiments. (66), e3683 (2012).
- Davenport, A. J., et al. CAR-T Cells Inflict Sequential Killing of Multiple Tumor Target Cells. Cancer Immunology Research. 3 (5), 483-494 (2015).
- Hegde, M., et al. Tandem CAR T cells targeting HER2 and IL13Ralpha2 mitigate tumor antigen escape. The Journal of Clinical Investigation. 126 (8), 3036-3052 (2016).
- Jin, J., et al. Enhanced clinical-scale manufacturing of TCR transduced T-cells using closed culture system modules. Journal of Translational Medicine. 16 (1), 13 (2018).
- Weiskopf, K. Cancer immunotherapy targeting the CD47/SIRPalpha axis. European Journal of Cancer. 76, 100-109 (2017).
- Huang, Y., Ma, Y., Gao, P., Yao, Z. Targeting CD47: the achievements and concerns of current studies on cancer immunotherapy. Journal of Thoracic Disease. 9 (2), E168-E174 (2017).
- Ma, S., Thorpe, P., Vitetta, E., Meyer, J. Combined targeting of exposed phosphatidylserine, CD47 and CD54 on human pancreatic tumor cells in a mouse xenograft model of human pancreatic cancer (P4455). The Journal of Immunology. 190 (1 Supplement), (2013).
- Yamamoto, K., et al. Emergence of CD47- high expression cells confers enhanced tumorigenicity upon KDM6B suppression in pancreatic cancer. Cancer Research. 76 (2 Supplement), (2016).
- Xu, D., et al. The development of CAR design for tumor CAR-T cell therapy. Oncotarget. 9 (17), 13991-14004 (2018).
- FDA. . Guidance for Industry, Potency Tests for Cellular and Gene Therapy Products. , (2017).
- Limame, R., et al. Comparative analysis of dynamic cell viability, migration and invasion assessments by novel real-time technology and classic endpoint assays. PLOS ONE. 7 (10), e46536 (2012).
- Chiu, C. H., et al. Comparison between xCELLigence biosensor technology and conventional cell culture system for real-time monitoring human tenocytes proliferation and drugs cytotoxicity screening. Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 12 (1), 149 (2017).
- Hillger, J. M., Lieuw, W. L., Heitman, L. H., IJzerman, A. P. Label-free technology and patient cells: from early drug development to precision medicine. Drug Discovery Today. 22 (12), 1808-1815 (2017).
