液体および固形腫瘍細胞を標的とするキメラ抗原受容体T細胞の効力を評価する定量的なインビトロ細胞質アッセイシステムを説明する。このプロトコルは、他の免疫エフェクター細胞、ならびに組み合わせ治療を評価するために拡張することができる。
癌に対するキメラ抗原受容体(CAR)T細胞療法は、小児急性リンパ球性白血病などの耐性および耐火性肝性悪性腫瘍に対して重要な臨床的利益を達成した。現在、この有望な治療法を他の造形癌に加えて固形腫瘍に拡張する取り組みが進められている。ここでは、固体および液体腫瘍細胞に対するユニークまたは優先的発現を有する抗原を標的とする強力なCAR T細胞の開発と産生について説明する。 これらのCAR T細胞の体外効力は、高感度インピーダンスベースのxCELリジェンスアッセイを用いてリアルタイムで評価される。具体的には、グルココルチコイド誘発腫瘍壊死因子受容体(TNFR)関連タンパク質(GITR)などの異なる共刺激シグナル伝達ドメインの影響が、CAR T細胞のインビトロ効力に対して調べられている。このレポートには、レンチウイルス遺伝子導入を用いた前臨床試験のためのCAR T細胞の生成、CAR T細胞の拡張、CAR発現の検証、xCELLigence効力アッセイの実行と分析などのプロトコルが含まれています。
近年、CAR T細胞療法は、再発および難治性造血性悪性腫瘍に対する癌免疫療法における最も顕著なブレークスルーの一つである。急性リンパ芽球性白血病に対するCD19指示CAR T細胞の最近の米国食品医薬品局(FDA)の承認により、 非ホジキンリンパ腫、およびびまん性大細胞型B細胞リンパ腫、および多発性骨髄腫に対するB細胞成熟抗原(BCMA)指向CAR T細胞の画期的な治療法の指定により、この技術は科学界で大きな興奮を生み出し、世界中の数多くの基礎、応用、臨床研究を促進してきました。 4、5.2019年1月には、700以上の臨床試験が臨床試験データベースに登録されました(clinicaltrials.gov)。これらの試験のうち約450件は、患者を積極的に募集し始めるか、または積極的に募集していた。臨床試験のほとんどは、血行性悪性腫瘍に焦点を当てており、CD19に加えて、CD20、CD22、およびBCMAを標的とするCAR T細胞を利用した臨床試験は、6、7と同様に進行中である。試験のほとんどは自家的なCAR T細胞療法を使用していますが、それらのかなりの数はまた、同種CAR T細胞8、9、10の有用性を探求しています。造形悪性腫瘍の有望な結果にもかかわらず、固形腫瘍を標的とするCAR T細胞の使用は、腫瘍内で排他的に発現される良好な標的の欠如、固形腫瘍および腫瘍「脱出」、およびCAR T細胞が腫瘍微小環境11にアクセスする際に有する困難を含む様々な理由で、クリニックではるかに困難であることが証明された。15.有効性に対するこれらの障壁を克服できる固形腫瘍特異的CAR T細胞の開発と「標的外腫瘍上」毒性の問題に対する重要な必要性がある。CAR T細胞の設計と試験において、多数のインビトロおよびインビボアプローチが保証されているが、堅牢で予測的なインビトロ効力アッセイは16、17が最も重要である。
CAR T細胞の効力を評価するために、様々なインビトロ法が開発されている。一般に、これらの効力アッセイは、標的腫瘍細胞に対するCAR T細胞の細胞溶解活性を直接測定するか、または(ii)標的細胞を殺す際にCAR T細胞によって放出されるサイトカインなどの代理マーカーを測定するかに応じて、2つの大きなカテゴリーに分けることができる。細胞溶解活性を直接測定する技術は、クロム-51放出アッセイ(CRA)18、蛍光プローブ19、20を用いて標的細胞のアポトーシスを測定するイメージングベースのアッセイ、およびアポトーシス標的細胞21を検出するフローサイトメトリーアッセイを含む。これらのアッセイでは、CAR T細胞は通常、放射性または蛍光プローブで事前に標識された標的細胞と共培養され、その後適切な測定が行われる。それは長い間、その感度のためにフィールドの金本位と考えられてきましたが、CRAにはいくつかの欠点があります。まず、エンドポイントアッセイであり、運動情報を提供しません。第二に、標的細胞は、細胞から浸出する傾向があり、バックグラウンドノイズ22を著しく増加させることができるクロム-51で標識する必要がある。最後に、放射性廃棄物の適切な予防措置と処分が必要です。代替アッセイは、効力の指標として標的細胞とのCAR T細胞相互作用の副産物を測定し、フローサイトメトリーベースの方法または酵素結合免疫吸着アッセイのいずれかを用いてCAR T細胞によって放出される種々のサイトカインの定量を含む。ここでも、これらは、所定の時点におけるサイトカインの累積放出を測定するエンドポイントアッセイであり、したがって、CAR T細胞の実際の細胞溶解活性を必ずしも反映していてもよい。
効力アッセイを開発する場合、特にCAR T細胞のような細胞ベースの治療の放出基準を定義するアッセイは、すべての相互作用が考慮する必要があり、アッセイの全体的な堅牢性と一貫性を低下させることができる別の変数であるため、アッセイは最小限の操作と実践的な時間を伴うことが重要です。さらに、CAR T細胞と腫瘍細胞との相互作用は動的プロセスであり、細胞上昇の速度などのこれらの動的相互作用に関する情報を提供することは、効力評価にとって最も重要である。これらの基準を念頭に、xCELLigenceリアルタイム細胞解析(RTCA)プラットフォームを利用したCAR T細胞のラベルフリーキネティック効力アッセイを開発しました。xCELLigenceは、各井戸の底部に埋め込まれた金のバイオセンサーを含む特殊なマイクロチタープレート(Eプレート)を利用しています。特定の抗体を用いてつながれた固形腫瘍細胞、または液体癌細胞のいずれかを用いて、これらのバイオセンサは、標的細胞数、細胞サイズ、細胞基質付着強度、および細胞間相互作用(すなわちバリア機能)17、23、24、25、26、27、28のリアルタイムCART細胞による変化を監視する。ワークフローは単純で、単にターゲットセルをEプレートのウェルにシードし、続いて異なるエフェクタ対ターゲット比でCAR T細胞を追加します(図1)。その後、バイオセンサが標的細胞の生存率を継続的に監視するにつれて、データは自動的にリアルタイムで表示されます。
過去15年間にわたり、xCELLigenceアッセイは、ナチュラルキラー(NK)細胞、T細胞、CAR T細胞、チェックポイント阻害剤、二重特異性抗体、集中性ウイルス、およびいくつかの併用療法17、29、30、31、32、33、34の効力を評価するために検証された。近年、xCELリジェンス効力アッセイを評価し、T細胞受容体(TCR)工学T細胞35を製造した。ここでは、臨床療法において固形腫瘍および液体腫瘍を標的とするように設計されたCAR T細胞の体外効力を評価するためのRTCAシステムを採用することを報告する。
キメラ抗原受容体は、細胞外単鎖可変断片(scFv領域)、ヒンジ領域、膜貫通領域、およびCD28およびOX4011、40などの受容体からのTCRシグナル伝達ドメインおよび追加の共刺激ドメインからなる細胞質ドメインから構成される多ドメインタンパク質である。安全で選択的で効果的なCALを設計するには、CAの設計における様々な順列を、インビトロ効力アッセイと、最終的には動物モデルを使用して徹底的にテストすることが不可欠です。本研究では、リアルタイムのインビトロ効力アッセイが有効なCALの設計をどのように知らせるかについて、プロトコルとワークフローを提供した。
任意のタイプの効力アッセイを設計する際には、特に製造目的のために、アッセイが敏感で、堅牢で、一貫しており、可能な限り作用機序に近いことが不可欠である。ここで説明するリアルタイム効力アッセイは、サイトカイン放出などのサロゲートマーカーを使用するのではなく、CAR T細胞の細胞溶解活性を直接測定するように設計されている。重要なことに、アッセイは、アッセイプレート(Eプレート)以外の染料や試薬などの追加成分や、細胞を維持するための推奨媒体を必要としない。さらに、アッセイは絶妙に敏感であり、他のラベルベースのアッセイ42、43、44と比較して非常に再現性の高いデータを提供する。さらに、xCELLigenceアッセイは、特定の細胞化の評価に最適な非常に低いエフェクター対ターゲット比を使用することが可能です。
xCELLigenceシステムの柔軟性と有用性を実証するために、我々は2つの腫瘍タイプ、すなわち造形起源と固形腫瘍の腫瘍に焦点を当てた。CD22指向CAR T細胞の効力を評価するために、ラジ細胞(すなわち、B細胞リンパ腫細胞株)を抗CD40抗体を用いてEプレートにテザリングした。Eプレートの底部にラジ細胞のテザリングは、井戸内のラジ細胞の生存率と数を反映するインピーダンス信号をもたらす。CD22-CAR T細胞の添加後、Raji細胞は時間およびエフェクタ依存的に選択的に死滅し、インピーダンス信号の時間依存的な減少に終わる。インピーダンスの低下は、細胞化またはラジ細胞の生存率の喪失を意味する17.抗体を用いたこの選択的テザリングアプローチは、他の液体腫瘍細胞株に拡張することができる。造馬起源の腫瘍細胞株を使用する代替戦略は、HeLa細胞で発現されるCD19のような腫瘍抗原を安定的に発現するように設計された付着癌細胞を使用することである。このアプローチの利点は、親 HeLa 細胞が容易に入手でき、特異性の負のコントロールとして使用できることです。このようなアプローチは、CHO-CD22対CHO細胞およびCHO-BCMA対CHO細胞29で既に検証されています。このような異なるアプローチを使用して、CAR T細胞の設計および有効性は容易にテストすることができる。xCELLigenceアッセイは本質的に柔軟であり、アッセイ条件は生理学的状態を最大限に近似するために調整することができる。
ここで説明した効力アッセイの大きな利点の1つは、シンプルな機能アッセイであり、遺伝子工学技術と組み合わせて、最適で有効なCALを高スループットで設計できることです。EGFR陽性癌細胞を標的とするように設計されたCAR T細胞についてここに示したように、アッセイは、異なるCAR構築物/変異体の相対活性を評価するために使用することができる。たとえば、GITR ドメインが CD3 ドメインの上流にある場合、CD3 ドメインの下流に位置する場合よりもはるかに堅牢な細胞溶解活性を示すことを示しました。
それは生体内CAR T細胞活性と完全に相関しないが、インビトロサイトカイン放出は、歴史的にCAR T細胞効力の尺度として使用されてきた。ここで説明するxCELLigenceベースの効力アッセイは、製造中または臨床応用のためにリリースされる前に細胞ベースの治療法を評価するために使用することができますが、これらの結果が生体内の有効性とどの程度相関しているかはまだありません確立。生体内の有効性は、インビトロアッセイ内で再現されない可能性のある因子および変数のホストに依存する。このような変数には、腫瘍部位へのCAR T細胞のホーミング、CAR T細胞の刺激および活性化および患者内で持続する能力、および腫瘍微小環境が含まれる。さらなる精製により、xCELLigenceアッセイは、これらの複雑なプロセスの一部をインビトロでモデル化することができるかもしれない。
ここで提供されるプロトコルは、ほとんどの付着癌細胞株および液体腫瘍細胞株の一部に適用される。しかし、原発性癌細胞などの臨床サンプルは、腫瘍の種類と相の複雑さのために、さらに検査され、最適化される必要があります。ここで説明する体外効力アッセイシステムは、CAR T細胞の潜在的な活性を反映するためだけに癌細胞株を使用していることは確かに注目に値する。人体内の実際の腫瘍状況は、特に動的腫瘍環境と発達のために固形腫瘍が標的とされる場合、はるかに複雑です。したがって、効力評価結果は、試験されたCAR T細胞の臨床有効性にあまりうまく変換されない場合がある。
要約すると、提示されたインピーダンスベースのxCELLigenceプラットフォームは、長期間、すなわち最大10日間の細胞殺害のラベルフリーの監視を可能にします。データ収集のためのこのような長い時間スケールのためのこの容量は、現在使用中であり、タイムポイント収集と手間のかかるサンプル操作のために複数の実験的反復を設定する必要がある他のアッセイと技術を区別します。さらに、エフェクター免疫細胞の最小限の信号寄与は、データ分析を簡素化します。ソフトウェアは、自動的にデータを処理し、細胞化、KT50などの有用なパラメータを生成することができます。この技術はすでに高感度(E:T比が1:20以下)と大きなダイナミックレンジ(E:T比は20:1~1:20)で、他のアッセイでは容易に達成できません。全体として、この技術の実装は、CAR T細胞試薬の開発を強化し、はるかに高いペースで分野を進める、より高いスループットスケールでより正確なデータ分析を可能にする必要があります。
The authors have nothing to disclose.
著者らは、本研究で利用された試薬および器具を提供してくれたProMabバイオテクノロジーとACEAバイオサイエンスに感謝する。
7-AAD | Biolegend | 420404 | |
Anti-CD40, liquid tumor killing assay kit | ACEA Biosciences | 8100005 | |
anti-human F(ab')2 | Jackson Immunoresearch laboratories. | 109-116-088 | |
APC anti-CD3 | Biolegend | 317318 | |
Assay medium RPMI1640 | life technologies.Corp | 11875-093 | |
CAR-T cell frozen solution CryostorCS10 | Stemcell technologies | #07930 | |
CAR-T cell medium from ProMab | AIM-V+300IFU/ml IL-2 | 12055-091 | |
CD3/CD28 coated microbeads, Dynabeads | Thermofisher | 11131D | |
DMEM | GElifesciences.com | SH30243.02 | |
FACS buffer | Promab made | ||
FBS | Lonza.com | 14-503F | |
HEK293FT | Thermo Fisher | R70007 | |
INFg ELISA kit | Thermo Fisher | ||
Lentiviral Packaging Mix | System Biosciences | VP100 | |
Lenti-X quantitative RT-PCR titration kit (Clontech) | Takara | 631235 | |
Promab medium for target cells | Varied with cell lines | ||
Real time Cellular Analyer | ACEA Biosciences | ||
Thermal cycler | Thermo Fisher | ||
Transduction enhance agent, Virus Transduction Enhancer (Alstem) | Transplus, Alstem | V020 | |
Transfection dilution solution, Opti-MEM | Thermo Fisher | ||
Transfection reagent, NanoFect reagent | Alstem | NF100 |