Мы описываем количественную систему анализа цитолизва в реальном времени в режиме реального времени для оценки потенции химерных антигенных рецепторов Т-клеток, нацеленных на жидкие и твердые опухолевые клетки. Этот протокол может быть расширен для оценки других клеток иммунного эффектора, а также комбинированных методов лечения.
Химерный рецептор антигена (CAR) Т-клеточная терапия рака достигла значительного клинического преимущества для устойчивых и огнеупорных гематологических злокачественных новообразований, таких как детский острый лимфоцитарный лейкоз. В настоящее время предпринимаются усилия по распространению этой многообещающей терапии на твердые опухоли в дополнение к другим гематологическим ракам. Здесь мы описываем развитие и производство мощных Т-клеток CAR, нацеленных на антигены с уникальным или преференциальным выражением на твердых и жидких опухолевых клетках. Потенция in vitro этих т-клеток CAR затем оценивается в режиме реального времени с помощью высокочувствительного анализа на основе импеданса xCELLigence. В частности, исследуется влияние различных дорогостоящих сигнальных доменов, таких как глюкокортикоидноидный рецептор фактора некроза опухоли (TNFR), связанный с протеином (GITR), на потенцию in vitro Т-клеток CAR. Этот отчет включает в себя протоколы для: генерации CAR Т-клеток для доклинических исследований с использованием трансдукции ллентивирного гена, расширение Т-клеток CAR, проверка экспрессии CAR, а также запуск и анализ анализ потенций xCELLigence.
В последние годы Т-клеточная терапия CAR стала одним из самых заметных прорывов в иммунотерапии рака для рецидивов и огнеупорных гематопоитических злокачественных новообразований. С недавним УПРАВЛЕНИЕм по контролю за продуктами и лекарствами США (FDA) одобрение CD19-направленных Т-клеток CAR для острого лимфобластного лейкоза, неходжкинской лимфомы, и диффузной большой В-клеточной лимфомы, и назначение прорывной терапии для B-клеточного созревания антигена (BCMA)-направленных CAR Т-клеток для множественной миеломы, эта технология вызвала большое волнение в научном сообществе и подпитывается многочисленные основные, прикладные, и клинические исследования во всем мире1,2,3, 4,5. В январе 2019 года в базе данных клинических испытаний было зарегистрировано более 700 клинических испытаний (clinicaltrials.gov); около 450 из этих испытаний либо собирались начать, либо активно набирали пациентов. Большинство клинических испытаний сосредоточены на гематологических злокачественных новообразований, и клинические испытания с использованием CAR Т-клеток ориентации CD20, CD22, и BCMAs, в дополнение к CD19, продолжаются, а также6,7. Хотя большинство испытаний используют аутологичное CAR Т-клеточная терапия, значительное число из них также изучают полезность аллогенных CAR Т-клеток8,9,10. Несмотря на многообещающие результаты с гематологическими злокачественными новообразованиями, использование Т-клеток CAR для целевой твердых опухолей оказалось гораздо сложнее в клинике по целому ряду причин, в том числе, но не ограничиваясь отсутствием хороших целей, которые исключительно выражены в опухоли, неоднородность твердых опухолей и опухоли “побег”, и трудности, что CAR T клетки имеют в доступе к микросреде11,12 , 12 , 12 , 12 , 12 , 12 , 12 , 12 , 12 , 12 , 12 , 12,12, 15. Существует острая необходимость в развитии твердых опухоли конкретных Т-клеток, которые могут преодолеть эти барьеры на пути к эффективности и проблемы “на целевой опухоли” токсичности. В то время как множество in vitro и in vivo подходы оправданы в разработке и тестировании CAR Т-клеток, надежный и прогностический анализ потенции in vitro имеет первостепенное значение16,17.
Для того, чтобы оценить потенцию CAR Т-клеток, различные методы in vitro были разработаны. В целом, эти анализы потенции могут быть разделены на две широкие категории в зависимости от того, они (i) непосредственно измерить цитолитической активности т-клеток CAR против целевых опухолевых клеток, или (ii) измерения суррогатных маркеров, таких как цитокины, которые высвобождаются КЛЕТКи CAR Т, как они убивают клетки-мишени. Методы, которые измеряют цитолитическую активность непосредственно включают анализ выброса хрома-51 (CRA)18, визуализации на основе анализов, которые измеряют апоптоз клеток-мишеней с помощью флуоресцентных зондов19,20, и поток цитометрии анализы, которые обнаруживают апоптотические клетки-мишени21. В этих анализах, CAR Т-клетки, как правило, совместно культивируется с целевыми клетками, которые были предварительно помечены радиоактивными или флуоресцентными зондами, а затем соответствующие измерения. Хотя он уже давно считается золотым стандартом в области из-за его чувствительности, CRA имеет некоторые недостатки. Во-первых, это конечная точка ассоса и не предоставляет кинетическую информацию. Во-вторых, целевые клетки должны быть помечены хромом-51, который имеет тенденцию выщелачиваться из клеток и может значительно увеличить фоновый шум22. Наконец, это требует надлежащих мер предосторожности и удаления радиоактивных отходов. Альтернативные анализы, которые измеряют побочные продукты взаимодействия Т-клеток CAR с клетками-мишенями как признак потенции, включают количественную оценку различных цитокинов, выделяемых Т-клетками CAR, используя либо методы цитометрии, либо связанные с ферментами иммуносорбентные анализы. Опять же, это конечные анализы, которые измеряют кумулятивное высвобождение цитокинов в данный момент времени и, таким образом, не обязательно могут отражать фактическую цитолитической активности Т-клеток CAR.
При разработке потенции анализ, особенно тот, который определяет критерии выпуска для клеточной терапии, такие как CAR Т-клеток, очень важно, чтобы анализ включать минимальные манипуляции и практические время, потому что каждое взаимодействие является еще одной переменной, которая должна быть учтена и может уменьшить общую надежность и последовательность анализ. Кроме того, взаимодействие Т-клеток CAR с опухолевыми клетками является динамичным процессом, и предоставление информации об этих динамических взаимодействиях, таких как скорость цитолиза, имеет первостепенное значение для оценки потенции. С учетом этих критериев мы разработали анализ кинетической потенции без этикетки для т-клеток CAR, которая использует платформу анализа клеток xCELLigence в реальном времени (RTCA). xCELLigence использует специализированные микротитерные пластины (E-plates), которые содержат биосенсоры золота, встроенные в нижней части каждой скважины. Работая либо с приверженцами твердых опухолевых клеток, или жидких раковых клеток, которые были привязаны с помощью конкретных антител, эти биосенсоры монитор в режиме реального времени CAR T-клеток индуцированных изменений в целевом количестве клеток, размер клеток, клеточная субстрата крепления силы, и клеточной клетки взаимодействия (т.е. барьер функции)17,23,24,25,26,27,28. Рабочий процесс прост и включает в себя просто посев целевых клеток в скважины E-плиты, а затем добавление CAR Т-клеток в различных сэффектор ов с точки зрения целевых соотношений (Рисунок 1). Впоследствии, поскольку биосенсоры непрерывно контролируют жизнеспособность целевых ячеек, данные автоматически отображаются в режиме реального времени.
За последние 15 лет анализ xCELLigence был проверен для оценки потенции естественных клеток убийцы (НК), Т-клеток, Т-клеток, ингибиторов контрольных точек, биспецифических антител, онколитических вирусов и некоторых комбинированных терапий17,29,30,31,32,33,34. Недавно, xCELLigence потенции асси была оценена для производства Т-клеточных рецепторов (TCR) инженерии Т-клеток35. Здесь мы сообщаем, используя систему RTCA для оценки потенции в пробирке CAR Т-клеток, предназначенных для целевой твердых опухолей и жидких опухолей в клинических методах лечения.
Химерные рецепторы антигена являются многодоменными белками, состоящими из внеклеточного одноцепного переменного фрагмента (область scFv), области шарнира, трансмембранной области и цитоплазматического домена, состоящего из доменов Сигнализации TCR и дополнительных затратных доменов от рецепторов, таких как CD28 и OX4011,40. Для разработки безопасных, селективных и эффективных CARs, крайне важно, чтобы различные перестановки в дизайне CARs тщательно протестированы с использованием in vitro потенции анализы и, в конечном итоге, животных моделей. В этом исследовании мы предоставили протокол и рабочий процесс о том, как анализ потенции in vitro может информировать дизайн эффективных ЦАРов.
При разработке любого типа потенции, особенно для производственных целей, крайне важно, чтобы асссе будет чувствительным, надежным, последовательным, и как можно ближе к механизму действия, как это возможно16,17,41. Описанная здесь потенция в реальном времени предназначена для измерения цитолитической активности Т-клетки CAR напрямую, а не с помощью суррогатного маркера, такого как высвобождение цитокинов. Важно отметить, что для проведения ассея не требуется никаких дополнительных компонентов, таких как красители или реагенты, кроме пластины для ассеа (E-Plate) и рекомендуемых носителей для поддержания клеток. Кроме того, анализ является изысканно чувствительным и обеспечивает высоко воспроизводимые данные по сравнению с другими этикетками на основе анализов42,43,44. Кроме того, анализ xCELLigence поддается использованию очень низких коэффициентов эффектора к цели, что идеально подходит для оценки конкретного цитолиза.
Для того, чтобы продемонстрировать гибкость и полезность системы xCELLigence, мы сосредоточились на двух типах опухолей, а именно на опухолях гематологического происхождения и твердых опухолях. Для того, чтобы оценить потенцию CD22-направленных Т-клеток CAR, клетки Раджи (т.е. В-клеточная лимфома клеточной линии) были привязаны к E-плиты с помощью анти-CD40 антитела. Привязка клеток Раджи к нижней части E-плит приводит к сигналу импеданса, который отражает жизнеспособность и количество клеток Раджи в колодце. После добавления Клеток CD22-CAR T, клетки Раджи выборочно убойны в time- и effector-dependent образе, кульминацией в времени-зависимом уменьшении в сигнале impedance. Падение импеданса означает цитолиза или потерю жизнеспособности клеток Раджи17. Этот селективный подход привязывая используя антитела можно распространить к другим жидкостным линиям клетки тумора. Альтернативная стратегия использования опухолевых клеток линий гематологического происхождения заключается в использовании адептов раковых клеток, которые разработаны, чтобы застойно выразить опухолевые антигены, такие как CD19, выраженные в клетках HeLa. Преимущество этого подхода заключается в том, что родительские клетки HeLa легко доступны и могут быть использованы в качестве отрицательного контроля за спецификой. Такой подход уже был подтвержден с CHO-CD22 против CHO клеток и CHO-BCMAs против CHO ячеек29. Используя такие различные подходы, CAR Т-клеток дизайн и эффективность могут быть легко протестированы. XCELLigence асссе по своей сути гибок, и условия ассеса могут быть скорректированы для того, чтобы максимально приблизить физиологические условия.
Одним из основных преимуществ анализа потенции мы описали здесь, что это простой функциональный анализ и может быть использован в сочетании с генной инженерии методы для разработки оптимальных и эффективных CARs в высокой пропускной способностью моды. Как было показано здесь для CAR Т-клеток, предназначенных для целевой EGFR-положительных раковых клеток, ассс можно использовать для оценки относительной активности различных конструкций CAR / мутантов. Например, мы показали, что, когда домен GITR расположен вверх по течению домена CD3, он показывает гораздо более надежную цитолитическую активность, чем когда он расположен ниже по течению домена CD3.
Хотя это не коррелирует идеально с активностью in vivo CAR T клеток, в vitro цитокинов релиз исторически используется в качестве меры потенции CAR Т-клеток. Хотя xCELLigence основе потенции оценки, описанные здесь могут быть использованы для оценки клеточной терапии во время производства или до освобождения для клинического применения, насколько хорошо эти результаты коррелируют с эффективностью in vivo еще не было Установлено. Эффективность In vivo зависит от множества факторов и переменных, которые не могут быть повторены в рамках анализа in vitro. К таким переменным относятся: самонаводящиеся Т-клетки CAR к месту опухоли, стимуляция и активация Т-клетки CAR и ее способность сохраняться внутри пациента, а также микроокружение опухоли. При дальнейшем уточнении анализ xCELLigence может быть способен моделировать некоторые из этих сложных процессов in vitro.
Протокол, представленный здесь, применяется к большинству адептов линий раковых клеток и некоторым линиям клеток жидкой опухоли. Клинические образцы, такие как первичные раковые клетки, однако, должны быть дополнительно протестированы и оптимизированы из-за сложности типов опухоли и фаз. Это, безусловно, стоит отметить, что in vitro потенции системы анализа, описанной здесь использует раковые клетки линий только для отражения потенциальной активности CAR Т-клеток. Реальная ситуация опухоли внутри человеческого тела является гораздо более сложным, особенно когда твердая опухоль является мишенью, из-за динамической опухолевой среды и развития. Таким образом, результат оценки потенции не может перевести очень хорошо в клинической эффективности CAR Т-клеток испытания.
Таким образом, представленная платформа xCELLigence на основе импедеданса позволяет бесименно контролировать убийство клеток в течение длительного периода времени, а именно до 10 дней. Эта способность для такой длинной временной шкалы для сбора данных отличает технологию от других анализов, которые в настоящее время используются и которые требуют создания нескольких экспериментальных репликаторов для сбора временных точек и трудоемких манипуляций образца. Кроме того, минимальный сигнальный вклад эффектора иммунных клеток упрощает анализ данных. Программное обеспечение может обрабатывать данные автоматически и генерировать полезные параметры, такие как процент цитолиза, KT50 и т.д. Технология уже продемонстрировала высокую чувствительность (с соотношениями E:T как низко как 1:20) и большой динамический диапазон (с e:T соотношения от 20:1 до 1:20), который не легко достичь с другими анализами. В целом, внедрение этой технологии должно позволить более точный анализ данных по более высокой пропускной шкале, что позволит повысить развитие Т-клеточных реагентов CAR, продвигая поле гораздо более высокими темпами.
The authors have nothing to disclose.
Авторы благодарят ProMab Biotechnologies и ACEA Biosciences за предоставление реагентов и инструментов, используемых в данном исследовании.
7-AAD | Biolegend | 420404 | |
Anti-CD40, liquid tumor killing assay kit | ACEA Biosciences | 8100005 | |
anti-human F(ab')2 | Jackson Immunoresearch laboratories. | 109-116-088 | |
APC anti-CD3 | Biolegend | 317318 | |
Assay medium RPMI1640 | life technologies.Corp | 11875-093 | |
CAR-T cell frozen solution CryostorCS10 | Stemcell technologies | #07930 | |
CAR-T cell medium from ProMab | AIM-V+300IFU/ml IL-2 | 12055-091 | |
CD3/CD28 coated microbeads, Dynabeads | Thermofisher | 11131D | |
DMEM | GElifesciences.com | SH30243.02 | |
FACS buffer | Promab made | ||
FBS | Lonza.com | 14-503F | |
HEK293FT | Thermo Fisher | R70007 | |
INFg ELISA kit | Thermo Fisher | ||
Lentiviral Packaging Mix | System Biosciences | VP100 | |
Lenti-X quantitative RT-PCR titration kit (Clontech) | Takara | 631235 | |
Promab medium for target cells | Varied with cell lines | ||
Real time Cellular Analyer | ACEA Biosciences | ||
Thermal cycler | Thermo Fisher | ||
Transduction enhance agent, Virus Transduction Enhancer (Alstem) | Transplus, Alstem | V020 | |
Transfection dilution solution, Opti-MEM | Thermo Fisher | ||
Transfection reagent, NanoFect reagent | Alstem | NF100 |