Nous décrivons un système d’essai in vitro quantitatif de cytolyse en temps réel pour évaluer la puissance des cellules De T de récepteur d’antigène chimérique ciblant les cellules tumorales liquides et pleines. Ce protocole peut être étendu pour évaluer d’autres cellules effectrices immunitaires, ainsi que des traitements combinés.
La thérapie à cellule T du récepteur d’antigène chimérique (CAR) pour le cancer a réalisé l’avantage clinique significatif pour les malignités hématologiques résistantes et réfractaires telles que la leucémie lymphocytique aigue d’enfance. Des efforts sont actuellement en cours pour étendre cette thérapie prometteuse aux tumeurs solides en plus d’autres cancers hématologiques. Ici, nous décrivons le développement et la production des cellules T puissantes de CAR ciblant des antigènes avec l’expression unique ou préférentielle sur les cellules de tumeur pleines et liquides. La puissance in vitro de ces lymphocytes T CAR est ensuite évaluée en temps réel à l’aide de l’inédit xCELLigence très sensible à base d’impédance. Plus précisément, l’impact de différents domaines de signalisation costimulatory, tels que le récepteur de facteur de nécrose tumorale induit par les glucocorticoïdes (TNFR) (GITR), sur la puissance in vitro des cellules T de CAR est examiné. Ce rapport comprend des protocoles pour : générer des lymphocytes T CAR pour des études précliniques utilisant la transduction de gènes lentiviraux, l’expansion des cellules T de carRAC, la validation de l’expression de la RCA et l’exécution et l’analyse des essais de puissance xCELLigence.
Ces dernières années, la thérapie à cellule T de CAR a été l’une des percées les plus importantes dans l’immunothérapie de cancer pour les malignités hématopoïétiques récidivantes et réfractaires. Avec l’approbation récente de la Food and Drug Administration (FDA) des cellules T DE dirigées par CD19 pour la leucémie lymphoblastique aigue, le lymphome non hodgkinien, et le lymphome diffus de grande cellule B, et la désignation de la thérapie de percée pour l’antigène de maturation de B-cellule (BCMA)-dirigé des cellules de CAR pour le myélome multiple, cette technologie a généré une grande excitation dans la communauté scientifique et a alimenté de nombreuses études fondamentales, appliquées, et cliniques dans le monde entier2,3, 3, 4,5. En janvier 2019, plus de 700 essais cliniques ont été enregistrés dans la base de données des essais cliniques (clinicaltrials.gov); environ 450 de ces essais étaient sur le point de commencer ou recrutaient activement des patients. La plupart des essais cliniques sont axés sur les malignités hématologiques, et les essais cliniques utilisant des cellules T CAR ciblant CD20, CD22, et BCMAs, en plus de CD19, sont en cours ainsi6,7. Alors que la plupart des essais utilisent autologue CAR T-cell thérapie, un nombre significatif d’entre eux explorent également l’utilité des cellules allogéniques CAR T8,9,10. Malgré des résultats prometteurs avec des malignités hématologiques, l’utilisation de cellules T CAR pour cibler les tumeurs solides s’est avérée beaucoup plus difficile dans la clinique pour une variété de raisons, y compris, mais pas limité à l’absence de bonnes cibles qui sont exclusivement exprimées dans la tumeur, l’hétérogénéité des tumeurs solides et la tumeur “évasion”, et la difficulté que les cellules CAR T ont dans l’accès au microenvironnement tumoral11,12,13,14, 15. Il y a un besoin critique pour le développement des cellules T pleines tumeur-spécifiques de CAR qui peuvent surmonter ces barrières à l’efficacité et le problème de la toxicité de « tumeur de cible-off ». Bien qu’une multitude d’approches in vitro et in vivo soient justifiées dans la conception et l’essai des lymphocytes T CAR, un essai de puissance in vitro robuste et prédictif est d’une importance primordiale16,17.
Afin d’évaluer la puissance des lymphocytes T CAR, diverses méthodes in vitro ont été développées. En général, ces essais de puissance peuvent être divisés en deux grandes catégories selon qu’ils (i) mesurent directement l’activité cytolytique des cellules T de CAR contre les cellules tumorales cibles, ou (ii) mesurent des marqueurs de substitution tels que des cytokines qui sont libérés par les cellules T de CAR pendant qu’elles tuent les cellules cibles. Les techniques qui mesurent l’activité cytolytique comprennent directement l’essai de libération de chrome-51 (CRA)18, les essais basés sur l’imagerie qui mesurent l’apoptose des cellules cibles à l’aide de sondes fluorescentes19,20, et les essais de cytométrie de flux qui détectent les cellules cibles apoptotiques21. Dans ces essais, les lymphocytes T CAR sont généralement co-cultivés avec des cellules cibles qui ont été pré-étiquetées avec des sondes radioactives ou fluorescentes, suivies d’une mesure appropriée. Bien qu’elle ait longtemps été considérée comme l’étalon-or dans le domaine en raison de sa sensibilité, l’ARC présente certains inconvénients. Tout d’abord, il s’agit d’un point de terminaison et ne fournit pas d’informations cinétiques. Deuxièmement, les cellules cibles doivent être étiquetées avec du chrome-51 qui tend à lessituer hors des cellules et peut augmenter de manière significative le bruit de fond22. Enfin, il faut prendre les précautions et l’élimination des déchets radioactifs. Les essais alternatifs, qui mesurent les sous-produits de l’interaction de CELLULES T de CAR avec des cellules cibles comme indication de puissance, incluent la quantitation de diverses cytokines libérées par des cellules T de CAR utilisant des méthodes basées sur la cytométrie de flux ou des essais immunosorbent enzymatiques. Encore une fois, il s’agit d’essais de point de terminaison qui mesurent la libération cumulative des cytokines à un moment donné et, par conséquent, ne reflètent pas nécessairement l’activité cytolytique réelle des lymphocytes T CAR.
Lors de l’élaboration d’un analyse de puissance, en particulier celui qui définit les critères de libération pour une thérapie cellulaire comme une cellule T CAR, il est essentiel que l’analyse implique des manipulations minimales et le temps pratique parce que chaque interaction est une autre variable qui doit être pris en compte et peut diminuer la robustesse globale et la cohérence de l’analyse. En outre, l’interaction des cellules T de CAR avec les cellules de tumeur est un processus dynamique, et fournir l’information au sujet de ces interactions dynamiques, telles que le taux de cytolyse, est d’importance primaire pour l’évaluation de puissance. Avec ces critères à l’esprit, nous avons développé un analyse de puissance cinétique sans étiquette pour les cellules T CAR qui utilise la plate-forme d’analyse cellulaire en temps réel xCELLigence (RTCA). xCELLigence utilise des plaques de microtiter spécialisées (E-Plates) qui contiennent des biocapteurs d’or intégrés dans le fond de chaque puits. Travaillant avec des cellules tumorales solides adhérentes, ou des cellules cancéreuses liquides qui ont été attachées à l’aide d’anticorps spécifiques, ces biocapteurs surveillent en temps réel les changements induits par les cellules T de CAR dans le nombre de cellules cibles, la taille des cellules, la force d’attachement de cellules-substrat, et les interactions de cellule-cellule (c.-à-d. fonction de barrière)17,23,24,25,26,27,28. Le flux de travail est simple et consiste simplement à ensemencer les cellules cibles dans les puits des E-Plates, suivie de l’ajout des lymphocytes T CAR à différents rapports effector-cible (figure 1). Par la suite, comme les biocapteurs surveillent en permanence la viabilité des cellules cibles, les données sont automatiquement affichées en temps réel.
Au cours des 15 dernières années, l’évaluation xCELLigence a été validée pour évaluer la puissance des cellules tueuses naturelles (NK), des lymphocytes T, des lymphocytes T CAR, des inhibiteurs de point de contrôle, des anticorps bispécifiques, des virus oncolytiques, et certaines thérapies combinées17,29,30,31,32,33,34. Récemment, l’assay de puissance de xCELLigence a été évalué pour la fabrication des lymphocytes T (TCR) des lymphocytes T35. Ici nous rapportons employer le système de RTCA pour évaluer la puissance in vitro des cellules t de CAR conçues pour cibler les tumeurs pleines et les tumeurs liquides dans les thérapies cliniques.
Les récepteurs d’antigènes chimériques sont des protéines multidomaines composées d’un fragment variable extracellulaire à une seule chaîne (région de scFv), d’une région charnière, d’une région transmembranaire et d’un domaine cytoplasmique composé de domaines de signalisation TCR et de domaines costimulatory supplémentaires provenant de récepteurs tels que CD28 et OX4011,40. Pour concevoir des RAC sûrs, sélectifs et efficaces, il est impératif que les diverses permutations dans la conception des RAC soient soigneusement testées à l’aide d’essais de puissance in vitro et, éventuellement, de modèles animaux. Dans cette étude, nous avons fourni un protocole et un flux de travail sur la façon dont un test de puissance in vitro en temps réel peut éclairer la conception de RAC efficaces.
En concevant n’importe quel type d’essai de puissance, particulièrement aux fins de fabrication, il est impératif que l’essai soit sensible, robuste, cohérent, et aussi proche du mécanisme d’action que possible16,17,41. L’exemple de puissance en temps réel décrit ici est conçu pour mesurer l’activité cytolytique de la cellule T DE RCA directement plutôt que d’utiliser un marqueur de substitution comme la libération de cytokine. Fait important, l’assay ne nécessite pas de composants supplémentaires tels que les colorants ou les réactifs autres que la plaque d’assay (E-Plate) et les supports recommandés pour maintenir les cellules. En outre, l’analyse est extrêmement sensible et fournit des données hautement reproductibles par rapport à d’autres essais basés sur l’étiquette42,43,44. En outre, l’évaluation xCELLigence est prête à utiliser des rapports effector–cibles très faibles qui est idéal pour l’évaluation de la cytolyse spécifique.
Afin de démontrer la flexibilité et l’utilité du système xCELLigence, nous nous sommes concentrés sur deux types de tumeur, à savoir les tumeurs d’origine hématologiques et les tumeurs solides. Afin d’évaluer la puissance des lymphocytes T CAR dirigés par CD22, les cellules Raji (c.-à-d. une lignée cellulaire de lymphome à cellules B) ont été attachées aux E-Plates à l’aide d’un anticorps anti-CD40. L’attache des cellules Raji au fond des E-Plates donne un signal d’impédance qui reflète la viabilité et le nombre de cellules Raji dans le puits. Après l’ajout des cellules T CD22-CAR, les cellules Raji sont sélectivement tuées d’une manière dépendante du temps et de l’effet, aboutissant à une diminution dépendante du temps dans le signal d’impédance. La baisse de l’impédance signifie cytolyse ou perte de viabilité des cellules Raji17. Cette approche sélective d’attache utilisant des anticorps peut être étendue à d’autres lignées cellulaires de tumeur liquide. Une stratégie alternative à l’utilisation des lignes de cellules tumorales d’origine hématologique est d’utiliser des cellules cancéreuses adhérentes qui sont conçues pour exprimer de façon stable les antigènes tumoraux, tels que CD19 exprimé s’exprimer dans les cellules HeLa. L’avantage de cette approche est que les cellules HeLa parentales sont facilement disponibles et peuvent être utilisées comme un contrôle négatif pour la spécificité. Une telle approche a déjà été validée avec les cellules CHO-CD22 vs CHO et CHO-BCMAs vs cho29. En utilisant ces différentes approches, la conception et l’efficacité des lymphocytes T CAR peuvent être facilement testées. L’analyse xCELLigence est intrinsèquement flexible, et les conditions d’analyse peuvent être ajustées afin d’approximer au maximum les conditions physiologiques.
Un avantage majeur de l’analyse de puissance que nous avons décrite ici est qu’il s’agit d’un simple test fonctionnel et peut être utilisé en conjonction avec des techniques de génie génétique pour concevoir des RAC optimaux et efficaces d’une manière à haut débit. Comme cela a été montré ici pour les cellules T CAR conçues pour cibler les cellules cancéreuses EGFR-positives, l’analyse peut être utilisée pour évaluer l’activité relative de différentes constructions/mutants de RCA. Par exemple, nous avons montré que lorsque le domaine GITR est situé en amont du domaine CD3, il montre une activité cytolytique beaucoup plus robuste que lorsqu’il est situé en aval du domaine CD3.
Bien qu’il ne soit pas parfaitement corrélé avec l’activité in vivo des lymphocytes T CAR, la libération in vitro de cytokine a toujours été utilisée comme mesure de la puissance des lymphocytes T carRAC. Bien que l’essai de puissance xCELLigence décrit ici puisse être utilisé pour évaluer les thérapies à base de cellules pendant la fabrication ou avant d’être libéré pour l’application clinique, la façon dont ces résultats sont corrélés avec l’efficacité in vivo n’a pas encore été Établi. L’efficacité in vivo dépend d’une foule de facteurs et de variables qui peuvent ne pas être récapitulés dans un test in vitro. Ces variables incluent : le homing des cellules T de CAR au site de la tumeur, la stimulation et l’activation de la cellule T de CAR et sa capacité à persister dans le patient, et le microenvironnement de tumeur. Avec plus de raffinement, l’analyse xCELLigence peut être capable de modéliser certains de ces processus complexes in vitro.
Le protocole fourni ici s’applique à la plupart des lignées de cellules cancéreuses adhérentes et certaines des lignées cellulaires tumorales liquides. Les échantillons cliniques tels que les cellules cancéreuses primaires, cependant, doivent être davantage examinés et optimisés en raison de la complexité des types et des phases de tumeur. Il est certainement intéressant de noter que le système d’in vitro d’astodonte de puissance décrit ici utilise des lignées de cellules cancéreuses seulement pour refléter l’activité potentielle des cellules T de CAR. La situation réelle de tumeur à l’intérieur du corps humain est beaucoup plus complexe, particulièrement quand une tumeur pleine est visée, due à l’environnement dynamique de tumeur et au développement. Par conséquent, le résultat d’évaluation de puissance peut ne pas traduire très bien dans l’efficacité clinique des cellules T de CAR examinées.
En résumé, la plate-forme xCELLigence basée sur l’impédance présentée permet une surveillance sans étiquette de l’abattage cellulaire pendant une période prolongée, à savoir jusqu’à 10 jours. Cette capacité pour une si longue échelle temporelle pour la collecte de données différencie la technologie des autres essais qui sont actuellement utilisés et qui nécessitent la mise en place de multiples répliques expérimentales pour la collecte de points de temps et la manipulation laborieuse de l’échantillon. En outre, la contribution minimale du signal des cellules immunitaires effectrices simplifie l’analyse des données. Le logiciel peut traiter les données automatiquement et générer des paramètres utiles tels que le pourcentage de cytolyse, KT50, etc. La technologie a déjà fait preuve d’une sensibilité élevée (avec des ratios E:T aussi bas que 1:20) et d’une large plage dynamique (avec des rapports E:T de 20:1 à 1:20), ce qui n’est pas facile à réaliser avec d’autres essais. Dans l’ensemble, la mise en œuvre de cette technologie devrait permettre une analyse plus précise des données à une échelle de débit plus élevée qui améliorera le développement des réactifs à cellules T carRAC, faisant progresser le domaine à un rythme beaucoup plus élevé.
The authors have nothing to disclose.
Les auteurs remercient ProMab Biotechnologies et ACEA Biosciences d’avoir fourni les réactifs et les instruments utilisés dans cette étude.
7-AAD | Biolegend | 420404 | |
Anti-CD40, liquid tumor killing assay kit | ACEA Biosciences | 8100005 | |
anti-human F(ab')2 | Jackson Immunoresearch laboratories. | 109-116-088 | |
APC anti-CD3 | Biolegend | 317318 | |
Assay medium RPMI1640 | life technologies.Corp | 11875-093 | |
CAR-T cell frozen solution CryostorCS10 | Stemcell technologies | #07930 | |
CAR-T cell medium from ProMab | AIM-V+300IFU/ml IL-2 | 12055-091 | |
CD3/CD28 coated microbeads, Dynabeads | Thermofisher | 11131D | |
DMEM | GElifesciences.com | SH30243.02 | |
FACS buffer | Promab made | ||
FBS | Lonza.com | 14-503F | |
HEK293FT | Thermo Fisher | R70007 | |
INFg ELISA kit | Thermo Fisher | ||
Lentiviral Packaging Mix | System Biosciences | VP100 | |
Lenti-X quantitative RT-PCR titration kit (Clontech) | Takara | 631235 | |
Promab medium for target cells | Varied with cell lines | ||
Real time Cellular Analyer | ACEA Biosciences | ||
Thermal cycler | Thermo Fisher | ||
Transduction enhance agent, Virus Transduction Enhancer (Alstem) | Transplus, Alstem | V020 | |
Transfection dilution solution, Opti-MEM | Thermo Fisher | ||
Transfection reagent, NanoFect reagent | Alstem | NF100 |