Sıvı ve katı tümör hücrelerini hedefleyen kimerik antijen reseptör T hücrelerinin gücünü değerlendirmek için kantitatif gerçek zamanlı in vitro sitoz ispat sistemini tanımlıyoruz. Bu protokol diğer bağışıklık etki hücreleri değerlendirmek için uzatılabilir, yanı sıra kombinasyon tedavileri.
Kanser için şemerik antijen reseptörü (CAR) T-hücre tedavisi çocukluk akut lenfositik lösemi gibi dirençli ve refrakter hematolojik maligniteler için önemli klinik fayda sağlamıştır. Çabalar şu anda diğer hematolojik kanserlere ek olarak katı tümörler için bu umut verici tedavi genişletmek için devam etmektedir. Burada, katı ve sıvı tümör hücrelerinde benzersiz veya tercihli ekspresyon ile antijenleri hedefleyen güçlü CAR T hücrelerinin geliştirilmesini ve üretimini açıklıyoruz. Bu CAR T hücrelerinin in vitro potens sonra son derece hassas empedans tabanlı xCELLigence test kullanılarak gerçek zamanlı olarak değerlendirilir. Özellikle glukokortikoid kaynaklı tümör nekroz faktör reseptörü (TNFR)’e bağlı protein (GITR) gibi farklı kostimulatör sinyal etki alanlarının CAR T hücrelerinin in vitro gücü üzerindeki etkisi incelenmiştir. Bu rapor için protokoller içerir: lentiviral gen transdüksiyonu kullanarak preklinik çalışmalar için CAR T hücreleri üreten, CAR T hücrelerinin genişletilmesi, CAR ekspresyonunun doğrulanması, ve xCELLigence potens testleri nin çalıştırılması ve analiz imal edileb.
Son yıllarda, CAR T-hücre tedavisi nüks etmiş ve refrakter hematopoetik maligniteler için kanser immünoterapisinde en önemli atılımlardan biri olmuştur. Son ABD ile. Gıda ve İlaç İdaresi (FDA) akut lenfoblastik lösemi için CD19 yönettiği CAR T hücrelerinin onayı, non-Hodgkin lenfoma, ve diffüz büyük B-hücreli lenfoma, ve B-hücreli olgunlaşma antijeni için atılım tedavi atama (BCMA)-multipl miyelom için CAR T hücreleri yönettiği, bu teknoloji bilimsel toplumda büyük heyecan yarattı ve çok sayıda temel yakıt vardır, uygulanan, ve klinik çalışmalar dünya çapında ,1,3, 4,5. Ocak 2019’da, klinik deney veritabanında (clinicaltrials.gov) 700’den fazla klinik çalışma kaydedildi; Bu çalışmaların yaklaşık 450’si ya başlamak üzereydi ya da aktif olarak hasta ları işe almak üzereydi. Klinik çalışmaların çoğu hematolojik maligniteler üzerinde duruldu, ve CD20 hedefleyen CAR T hücreleri kullanan klinik çalışmalar, CD22, ve BCMA, CD19 ek olarak, de devam ediyor6,7. Çalışmaların çoğu otolog CAR T-hücre tedavisi kullanırken, bunların önemli bir kısmı da allojenik CAR Thücrelerininyarar keşfetmek 8,9,10. Hematolojik maligniteler ile umut verici sonuçlara rağmen, solid tümörleri hedeflemek için CAR T hücrelerinin kullanımı, sadece tümör de ifade edilen iyi hedeflerin eksikliği de dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere çeşitli nedenlerle klinikte çok daha zor olduğu kanıtlanmıştır, katı tümörler ve tümör heterojenite “kaçış”, ve zorluk CAR T hücrelerinin tümör mikroçevreerişen var11,12,13,14, 15. Etkinliği ve “hedef-off tümör” toksisitesi sorunu bu engelleri aşabilir katı tümöre özgü CAR T hücrelerinin geliştirilmesi için kritik bir ihtiyaç vardır. In vitro ve in vivo yaklaşımlar çok sayıda tasarım ve CAR T hücrelerinin test garanti ederken, sağlam ve tahmine dayalı in vitro potens testi birincil öneme sahiptir16,17.
CAR T hücrelerinin gücünü değerlendirmek için çeşitli in vitro yöntemler geliştirilmiştir. Genel olarak, bu potens tahlilleri,(i)CAR T hücrelerinin hedef tümör hücrelerine karşı sitolitik aktivitesini doğrudan ölçüp ölçmediklerine bağlı olarak iki geniş kategoriye ayrılabilir, ya da (ii) hedef hücreleri öldürürken CAR T hücreleri tarafından salınan sitokinler gibi taşıyıcı belirteçleri ölçerler. Doğrudan sitolitik aktiviteyi ölçmek teknikleri krom-51 serbest tahlil (Cra)18,floresan problar 19 kullanarak hedef hücrelerin apoptosis ölçmek görüntüleme tabanlı tahliller19,20, ve apoptotik hedef hücreleri tespit akış sitometri tahliller21. Bu tahlillerde, CAR T hücreleri genellikle radyoaktif veya floresan problarla önceden etiketlenmiş hedef hücrelerle birlikte yetiştirilir ve bunu uygun ölçümle takip eder. Uzun duyarlılığı nedeniyle alanında altın standart olarak kabul edilmiş olmasına rağmen, MKK bazı dezavantajları vardır. İlk olarak, bir uç nokta tsömültüs ve kinetik bilgi sağlamaz. İkinci olarak, hedef hücrelerin krom-51 ile etiketlenmiş olması gerekir hangi hücrelerin leach eğilimindedir ve önemli ölçüde arka plan gürültü artırabilir22. Son olarak, uygun önlemler ve radyoaktif atık bertaraf gerektirir. Potens in bir göstergesi olarak hedef hücreler ile CAR T-hücre etkileşiminin yan ölçüt alternatif tahliller, ya akış sitometri tabanlı yöntemler veya enzime bağlı immünosorbent tahlilleri kullanarak CAR T hücreleri tarafından yayımlanan çeşitli sitokinlerin nicel sayımı içerir. Bir kez daha, bu belirli bir zaman noktasında sitokinlerin kümülatif salınımını ölçmek ve böylece, mutlaka CAR T hücrelerinin gerçek sitoklitik aktivitesini yansıtmayabilir uç nokta tahlilleri vardır.
Bir potens analizi geliştirirken, özellikle bir CAR T-hücre gibi bir hücre tabanlı tedavi için serbest kalma kriterleri tanımlayan, her etkileşim için hesaba ihtiyacı olan ve genel sağlamlık ve test tutarlılığını azaltabilir başka bir değişken olduğu için test minimal manipülasyonlar ve eller-zaman içeren önemlidir. Ayrıca, tümör hücreleri ile CAR T hücrelerinin etkileşimi dinamik bir süreçtir ve sitolyz oranı gibi bu dinamik etkileşimler hakkında bilgi sağlamak, potens değerlendirme için birincil önemtaşımaktadır. Bu kriterleri göz önünde bulundurarak, xCELLigence gerçek zamanlı hücre analizi (RTCA) platformlarını kullanan CAR T hücreleri için etiketsiz kinetik potens testini geliştirdik. xCELLigence, her kuyunun dibine gömülü altın biyosensörler içeren özel mikrotiter plakalar (E-Plakalar) kullanır. Ya yapışık katı tümör hücreleri ile çalışma, ya da belirli antikorlar kullanılarak bağlı olan sıvı kanser hücreleri, bu biyosensörler hedef hücre numarası, hücre büyüklüğü, hücre-substrat eki gücü ve hücre-hücre etkileşimleri (yani bariyer fonksiyonu)17,23,24,25,26,27,28gerçek zamanlı CAR T hücre kaynaklı değişiklikleri izlemek . İş akışı basittir ve hedef hücrelerin sadece E-Plaka kuyularına tohumlamayı ve ardından car T hücrelerinin farklı efektör-hedef oranlarına eklenmesini içerir(Şekil 1). Daha sonra, biyosensörler hedef hücrelerin canlılığını sürekli olarak izledikçe veriler otomatik olarak gerçek zamanlı olarak görüntülenir.
Son 15 yıl içinde xCELLigence tsay doğal katil (NK) hücrelerinin potens değerlendirmek için doğrulanmıştır , T hücreleri, CAR T hücreleri, kontrol noktası inhibitörleri, bispesifik antikorlar, onkolitik virüsler, ve bazı kombinasyontedavileri 17,29,30,31,32,33,34. Son zamanlarda, xCELLigence potens tsay t-hücre reseptörü (TCR)-mühendislik T-hücreleri35üretimi için değerlendirildi. Burada, klinik tedavilerde katı tümörleri ve sıvı tümörleri hedeflemek üzere tasarlanmış CAR T hücrelerinin in vitro potensini değerlendirmek için RTCA sisteminin işe yaradığı bildirilmektedir.
Chimeric antijen reseptörleri bir hücre dışı tek zincirli değişken parça (scFv bölge), bir menteşe bölgesi, bir transmembran bölgesi ve CD28 ve OX4011,40gibi reseptörlerden TCR sinyal etki alanları ve ek kostimulatör etki alanlarından oluşan bir sitoplazmik etki alanı oluşan çok etki alanı proteinleridir. Güvenli, seçici ve etkili CAR tasarlamak için, CAR tasarımında çeşitli permütasyon iyice in vitro potens tahlilleri ve sonunda, hayvan modelleri kullanılarak test olması zorunludur. Bu çalışmada, gerçek zamanlı in vitro potens testin etkili CAR’lerin tasarımını nasıl bilgilendirebileceği ne üzere bir protokol ve iş akışı sağladık.
Özellikle üretim amaçlı, potens analizi her türlü tasarımında, bu tetki, sağlam, tutarlı hassas olması zorunludur ve mümkün olduğunca eylem mekanizmasına yakın16,17,41. Burada açıklanan gerçek zamanlı potens tsay doğrudan yerine sitokin serbest gibi bir vekil marker kullanarak CAR T hücresinin sitolitik aktivitesini ölçmek için tasarlanmıştır. Daha da önemlisi, teşp, boyalar veya reaktifler gibi, ispon plakası (E-Plaka) ve hücrelerin bakımı için önerilen ortam dışında ek bileşenler gerektirmez. Ayrıca, tahlil son derece hassas ve diğer etiket tabanlı tahliller42,43,44ile karşılaştırıldığında son derece çoğaltılabilir veri sağlar. Ayrıca, xCELLigence tsay belirli sitolizin değerlendirilmesi için ideal olan çok düşük efektör-hedef oranları kullanarak münasiptir.
KCELLigence sisteminin esnekliğini ve faydasını göstermek için hematolojik kökenli tümörler ve solid tümörler olmak üzere iki tümör tipiüzerinde yoğunlaştık. CD22-yönettiği CAR T hücrelerinin gücünü değerlendirmek için, Raji hücreleri (yani, bir B hücreli lenfoma hücre hattı) bir anti-CD40 antikor kullanılarak E-Plakalar bağlı edildi. Raji hücrelerinin E-Plates’in dibine tethering’i, kuyudaki Raji hücrelerinin canlılığını ve sayısını yansıtan bir empedans sinyali ile sonuçlanır. CD22-CAR T hücrelerinin eklenmesinden sonra Raji hücreleri seçici olarak zaman ve efektöre bağlı bir şekilde öldürülür ve empedans sinyalinde zamana bağlı bir azalma yla sonuçlanır. Empedanstaki düşüş sitoliz veya Raji hücrelerinin canlılığının17. Antikorlar kullanarak bu selektif tethering yaklaşım diğer sıvı tümör hücre hatları genişletilebilir. Hematolojik kökenli tümör hücre hatları kullanarak alternatif bir strateji, cd19 HeLa hücrelerinde ifade gibi tümör antijenleri stably ifade etmek için tasarlanmış yapışık kanser hücreleri kullanmaktır. Bu yaklaşımın avantajı ebeveyn HeLa hücreleri kolayca kullanılabilir ve özgüllük için olumsuz bir kontrol olarak kullanılabilir olmasıdır. Böyle bir yaklaşım zaten CHO-CD22 vs CHO hücreleri ve CHO-BCMAs vs CHO hücreleri29ile doğrulanmıştır. Bu tür farklı yaklaşımlar kullanılarak, CAR T-hücre tasarımı ve etkinliği kolayca test edilebilir. XCELLigence tsay doğal olarak esnektir ve doğal olarak ölçüm koşulları fizyolojik koşullara maksimum olarak yaklaşacak şekilde ayarlanabilir.
Burada açıklanan potens tsay önemli bir avantajı basit bir fonksiyonel tsay ve yüksek verimli bir şekilde optimum ve etkili CARs tasarlamak için genetik mühendislik teknikleri ile birlikte kullanılabilir olmasıdır. EGFR-pozitif kanser hücrelerini hedeflemek için tasarlanmış CAR T hücreleri için burada gösterildiği gibi, tsay farklı CAR yapıları / mutantlar göreli aktivitesini değerlendirmek için kullanılabilir. Örneğin, GITR etki alanı CD3 etki alanının yukarısında bulunduğunda, CD3 etki alanının aşağı akışına göre çok daha sağlam sitolitik etkinlik gösterdiğini gösterdik.
In vivo CAR T hücre aktivitesi ile mükemmel bir ilişki olmamasına rağmen, in vitro sitokin salınımı tarihsel CAR T hücre potens bir ölçüsü olarak kullanılmıştır. Burada açıklanan xCELLigence bazlı potens tahlili, üretim sırasında veya klinik uygulama için piyasaya sürülmeden önce hücre bazlı tedavilerin değerlendirilmesi için kullanılabilse de, bu sonuçların in vivo etkinliği ile ne kadar iyi ilişkili olduğu henüz Kurulan. In vivo etkinlik, in vitro bir töz de recapitulated olmayabilir faktörler ve değişkenler bir dizi bağlıdır. Bu değişkenler şunlardır: tümörün siteye CAR T hücrelerinin homing, stimülasyon ve CAR T hücresiaktivasyonu ve yeteneği hasta içinde devam etmek, ve tümör mikroçevre. Daha fazla arıtma ile xCELLigence tsay bu karmaşık süreçlerin bazı in vitro modelleme yeteneğine sahip olabilir.
Burada sağlanan protokol çoğu yapışık kanser hücre hatları ve bazı sıvı tümör hücre hatları için geçerlidir. Birincil kanser hücreleri gibi klinik örnekler, ancak, daha fazla test edilmesi ve tümör türleri ve aşamalarının karmaşıklığı nedeniyle optimize edilmesi gerekir. Kesinlikle burada açıklanan in vitro potens tsay sistemi sadece CAR T hücrelerinin potansiyel aktivitesini yansıtmak için kanser hücre hatları kullanır dikkati çekiyor. İnsan vücudunun içinde gerçek tümör durumu çok daha karmaşıktır, özellikle sağlam bir tümör hedeflendiğinde, dinamik tümör ortamı ve gelişimi nedeniyle. Bu nedenle, potens değerlendirme sonucu test EDILEN CAR T hücrelerinin klinik etkinliğine çok iyi bir şekilde çevrilmeyebilir.
Özetle, sunulan empedans tabanlı xCELLigence platformu, hücre öldürmenin etiketsiz olarak 10 güne kadar uzun bir süre izlenmesine olanak tanır. Veri toplama için bu kadar uzun bir zamansal ölçek için bu kapasite, teknolojiyi şu anda kullanılmakta olan ve zaman noktası toplama ve zahmetli numune işleme için birden fazla deneysel kopya oluşturmayı gerektiren diğer tahlillerden ayırır. Ayrıca, efektör bağışıklık hücrelerinin minimal sinyal katkısı veri analizini kolaylaştırır. Yazılım verileri otomatik olarak işleyebilir ve sitoliz, KT50, vb yüzdesi gibi yararlı parametreler oluşturabilir. Teknoloji zaten yüksek duyarlılık göstermiştir (1:20 gibi düşük E:T oranları ile) ve büyük bir dinamik aralık (E:T oranları ile 20:1 için 1:20), hangi kolayca diğer tahliller ile elde edilmez. Genel olarak, bu teknolojinin uygulanması car T-hücre reaktiflerinin gelişimini artıracak daha yüksek bir iş verme ölçeğinde daha doğru bir veri analizi ne izin vermelidir, çok daha yüksek bir hızda alan ilerleyen.
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar promab Biyoteknoloji ve ACEA Biosciences reaktifler ve bu çalışmada kullanılan aletleri sağlamak için teşekkür ederiz.
7-AAD | Biolegend | 420404 | |
Anti-CD40, liquid tumor killing assay kit | ACEA Biosciences | 8100005 | |
anti-human F(ab')2 | Jackson Immunoresearch laboratories. | 109-116-088 | |
APC anti-CD3 | Biolegend | 317318 | |
Assay medium RPMI1640 | life technologies.Corp | 11875-093 | |
CAR-T cell frozen solution CryostorCS10 | Stemcell technologies | #07930 | |
CAR-T cell medium from ProMab | AIM-V+300IFU/ml IL-2 | 12055-091 | |
CD3/CD28 coated microbeads, Dynabeads | Thermofisher | 11131D | |
DMEM | GElifesciences.com | SH30243.02 | |
FACS buffer | Promab made | ||
FBS | Lonza.com | 14-503F | |
HEK293FT | Thermo Fisher | R70007 | |
INFg ELISA kit | Thermo Fisher | ||
Lentiviral Packaging Mix | System Biosciences | VP100 | |
Lenti-X quantitative RT-PCR titration kit (Clontech) | Takara | 631235 | |
Promab medium for target cells | Varied with cell lines | ||
Real time Cellular Analyer | ACEA Biosciences | ||
Thermal cycler | Thermo Fisher | ||
Transduction enhance agent, Virus Transduction Enhancer (Alstem) | Transplus, Alstem | V020 | |
Transfection dilution solution, Opti-MEM | Thermo Fisher | ||
Transfection reagent, NanoFect reagent | Alstem | NF100 |