אנו מתארים כמותית בזמן אמת במערכת החשיבה של הפריה חוץ גופית כדי להעריך את העוצמה של מערכת הקולטן אנטיגן כימאריק תאי T מיקוד תאי הגידול נוזלי ומוצק. פרוטוקול זה ניתן להרחיב כדי להעריך תאים אחרים החיסון החיסונית, כמו גם טיפולים משולבים.
הקולטן אנטיגן הצ (רכב) T-cell טיפול בסרטן השיגה תועלת קלינית משמעותית עבור ממאירות המטולוגית עמידים ועקשן כגון ילדות לוקמיה לימפוציטית חריפה. המאמצים מתבצעת כעת כדי להאריך את הטיפול המבטיח גידולים מוצקים בנוסף סרטן המטולוגי אחרים. כאן, אנו מתארים את הפיתוח והייצור של תאים מכונית T חזק מיקוד אנטיגנים עם ביטוי ייחודי או מועדף על תאים סרטניים מוצק ונוזלי. העוצמה מחוץ לגופית של תאים אלה מכונית T הוא העריך מכן בזמן אמת באמצעות הxCELLigence הרגיש מאוד עכבה מבוססי-עכבת. באופן ספציפי, ההשפעה של תחומים שונים של מגירוי מחדש, כגון glucocorticoid המושרה נמק הגידול מקדם קולטן (TNFR)-חלבון הקשורים (מחקר), על האון מחוץ לתחום של תאי T מכונית נבדק. דו ח זה כולל פרוטוקולים עבור: יצירת תאים T רכב עבור מחקרים קדם-קליניים באמצעות התמרה גנטית העדשה, הרחבת תאי T רכב, אימות רכב ביטוי, ריצה וניתוח של xCELLigence העוצמה assays.
בשנים האחרונות, לטיפול ברכב T-cell היה אחד פריצות דרך הבולטים ביותר בטיפול חיסוני סרטן עבור ממאירות הישנות ועקשן המטפאות. עם מינהל המזון והתרופות האחרון בארה ב (FDA) אישור של תאים CD19 בבימויו של מכונית T עבור לוקמיה לימפובלסטית חריפה, שאינם הודג לימפומה, ו לפזר לימפומה גדולים תא b, ואת הייעוד של טיפול פריצת דרך עבור B-cell התבגרות אנטיגן (bcma)-בבימויו של מכונית T תאים מיאלומה נפוצה, טכנולוגיה זו יצרה התרגשות גדולה בקהילה המדעית והוא מתודלקרבים בסיסיים, מיושם, וקליני מחקרים ברחבי העולם1,2, 4,5. בינואר של 2019, יותר מ 700 ניסויים קליניים נרשמו במאגר הניסוי הקליני (clinicaltrials.gov); כ 450 של מבחנים אלה היו או להתחיל או היו באופן פעיל גיוס חולים. רוב הניסויים הקליניים מתמקדים ממאירות המטולוגית, וניסויים קליניים ניצול תאי T מכונית מיקוד CD20, CD22, ו bcmas, בנוסף CD19, הם שוטפים כמו גם6,7. בעוד רוב הניסויים משתמשים בטיפול אוטוולוגי מכונית t-cell, מספר משמעותי של אותם הם גם לחקור את השירות של המכונית allogenic T תאים8,9,10. למרות התוצאות המבטיחות עם ממאירות המטולוגית, השימוש בתאי t מכונית ליעד גידולים מוצקים הוכיחה להיות הרבה יותר קשה בקליניקה עבור מגוון סיבות, כולל אך לא מוגבל להעדר מטרות טובות אשר מבוטא באופן בלעדי בגידול, טרוגניות של גידולים מוצקים והגידול “לברוח”, ואת הקושי כי מכונית לתאי T יש גישה מיקרוסביבה הגידול11,12 15. יש צורך חיוני לפיתוח של מוצק הגידול בתאי T רכב אשר יכול להתגבר על המחסומים האלה יעילות ואת הבעיה של “על המטרה-off גידול” רעילות. בעוד שפע של מבחנה בגישות vivo מוצדקת בעיצוב ובדיקה של תאי T מכונית, חזקה וניבוי ברמת העוצמה מחוץ לגופית הוא בחשיבות העיקרית16,17.
כדי להעריך את העוצמה של תאי T רכב, שונים בשיטות מבחנה התפתחו. באופן כללי, העוצמה האלה ניתן לחלק לשתי קטגוריות רחבות, תלוי אם הם (i) ישירות למדוד את הפעילות cytolytic של מכונית T תאים נגד תאים סרטניים היעד, או (ii) למדוד סמנים פונדקאית כגון ציטוקינים שפורסמו על ידי תאי T רכב כפי שהם להרוג את תאי היעד. טכניקות המודדים פעילות cytolytic ישירות כוללים את הבחינה כרום-51 שחרור (מדבר)18, הדמיה מבוסס בחני אשר למדוד ואפופטוזיס של תאי היעד באמצעות הפלורסנט בדיקה19,20, וזרימה cy, לנסות בחני לזהות תאים היעד האפוטוטיים21. באלה assays התאים המכונית T הם בדרך כלל שיתוף תרבותי עם תאים היעד אשר כבר מראש עם בדיקה רדיואקטיבית או פלורסנט, ואחריו מדידה המתאימה. למרות שכבר מזמן נחשב לסטנדרט הזהב בתחום בשל רגישותו, למעברה יש כמה חסרונות. ראשית, זהו שיטת נקודות קצה ואינה מספקת מידע קינטי. שנית, את התאים היעד צריך להיות מתויג עם כרום-51 אשר נוטה לליץ מתוך התאים והוא יכול להגדיל באופן משמעותי את רעש הרקע22. לבסוף, זה דורש אמצעי זהירות נאותים וסילוק הפסולת הרדיואקטיבית. חלופה חלופית, אשר למדוד תוצרי לוואי של מכונית T-cell אינטראקציה עם תאי היעד כאינדיקציה של העוצמה, לכלול את הקוונט של ציטוקינים שונים שפורסמו על ידי מכונית T התאים באמצעות שיטות מבוססות הזרימה cy, או האנזים מקושר האנזימים assays. שוב, אלה נקודות הקצה אומר מה למדוד את המהדורה המצטברת של ציטוקינים בנקודת זמן נתונה, ולכן, לא ייתכן בהכרח לשקף את הפעילות cytolytic בפועל של תאים T רכב.
בעת פיתוח שיטת העוצמה, במיוחד אחד המגדיר את קריטריוני השחרור עבור טיפול מבוסס תא כגון מכונית T-cell, זה קריטי כי הדרישות כרוכות מניפולציות מינימליות והידיים על הזמן, כי כל אינטראקציה היא משתנה אחר שצריך להיות שנספרו והוא יכול להפחית את החוסן הכולל ועקביות של הטיפול. יתר על כן, האינטראקציה של תאי T רכב עם תאים סרטניים הוא תהליך דינמי, ומספק מידע על אינטראקציות דינמיות אלה, כגון שיעור cytolysis, הוא בחשיבות העיקרית להערכת העוצמה. עם הקריטריונים האלה בראש, פיתחנו ללא תווית שיטת העוצמה קינטי עבור תאי T מכונית מנצל את xCELLigence בזמן אמת ניתוח התא (RTCA) פלטפורמת. xCELLigence משתמשת לוחות microtiter מיוחדים (E-צלחות) המכילים ביוחיישנים זהב מוטבע בתחתית של כל באר. עבודה עם תאים הגידול מוצק חסיד, או תאים סרטניים נוזלי כי כבר קשור באמצעות נוגדנים ספציפיים, אלה ביולוגי לפקח בזמן אמת מכונית T שינויים המושרה בתא היעד מספר תא, גודל התא, תא-מצע הקובץ המצורף, ואינטראקציות תא תא (כלומר פונקציית המכשול)17,23,24,25,26,27,28. זרימת העבודה היא פשוטה וכרוכה פשוט לזריעה את התאים היעד לתוך הבארות של E-צלחות, ואחריו תוספת של תאי T רכב ביחס שונה שונים ליעד (איור 1). לאחר מכן, כשהחיישנים הביואקטיביים מנטרים ברציפות את הכדאיות של תאי היעד, הנתונים מוצגים באופן אוטומטי בזמן אמת.
במהלך 15 השנים האחרונות הxCELLigence מאומת על הערכת העוצמה של הרוצח הטבעי (NK) תאים, t תאים, מכונית t תאים, מעכבי במחסום, נוגדנים מסוימים, וירוסים oncolytic, וכמה טיפולים שילוב17,29,30,31,32,33,34. לאחרונה, שיטת העוצמה xCELLigence הוערכו לייצור קולטן תא T (TCR)-הנדסה T-תאים35. כאן אנו מדווחים על העסקת מערכת RTCA להערכת העוצמה מחוץ לגוף של תאי T מכונית נועד למקד גידולים מוצקים וגידולים נוזליים בטיפולים קליניים.
קולטני אנטיגן כימריים הם חלבונים עלת מורכב משבר בודד שרשרת יחיד משתנה (scfv אזור), אזור ציר, אזור טרנסרפידת, ותחום cytoplasmic המורכב של tcr איתות דומיינים ותחומים נוספים מגירוי מפני קולטנים כגון CD28 ו OX4011,40. כדי לעצב מכוניות בטוחות, סלקטיבית, ו תכליתי, זה הכרחי כי התמורות השונות בעיצוב של המכוניות נבדקו ביסודיות באמצעות העוצמה מחוץ למבחנה ובסופו של דבר, מודלים בעלי חיים. במחקר זה, סיפקנו פרוטוקול וזרימת עבודה לגבי האופן בו בזמן אמת בעזרת שיטת החוץ הגופית יכולים ליידע את העיצוב של מכוניות מסוימות.
בעיצוב כל סוג של שיטת העוצמה, במיוחד למטרות ייצור, הכרחי שהייחודיות תהיה רגישה, איתנה, עקבית וקרובה למנגנון הפעולה ככל האפשר16,17,41. שיטת העוצמה בזמן אמת שתוארה כאן נועדה למדוד את הפעילות cytolytic של תא T רכב ישירות ולא באמצעות סמן פונדקאית כגון שחרור cyטוקין. מעבר לכך, השיטה אינה דורשת כל מרכיב נוסף, כגון צבעים או ריאגנטים, מלבד צלחת הקיום (E-פלייט) והמדיה המומלצת לשמירת התאים. בנוסף, הגישה רגישה להפליא ומספקת נתונים מאוד מושווים בהשוואה ל-בחני42,43,44. יתרה מזאת, הxCELLigence הינה קלה לשימוש ביחס נמוך מאוד של אפקטור למטרה, המהווה יעד אידיאלי להערכת cytolysis ספציפי.
כדי להדגים את הגמישות ואת השירות של מערכת xCELLigence, יש לנו התמקדו שני סוגי הגידול, כלומר גידולים של המקור המטולוגי וגידולים מוצק. על מנת להעריך את העוצמה של תאים בבימויו של רכב T CD22, התאים ראג’י (כלומר, תא B-cell לימפומה קו) היו קשור E-צלחות באמצעות נוגדן anti-CD40. הקשירה של תאים של ראג’י לתחתית הלוחות האלקטרוניים גורמת לאות עכבה המשקפת את הכדאיות ואת מספר התאים של ראג’י בבאר. בעקבות התוספת של תאי T CD22-CAR, התאים ראג’י הם נהרגו באופן סלקטיבי בזמן, ו-והוא תלוי בצורה, ששיאה בירידה תלוי זמן באות העכבה. הירידה בעכבה מרמזת על cytolysis או אובדן הכדאיות של התאים ראג’י17. הגישה הסלקטיבית הזאת באמצעות נוגדנים ניתן להרחיב את קווי הגידול הנוזלי אחרים תאים. אסטרטגיה חלופית לשימוש קווי הגידול התאים של המקור המטולוגי היא להשתמש בתאי סרטן חסיד אשר מתוכננים באופן בלתי נשכח אנטיגנים הגידול, כגון CD19 מבוטא בתאי הלה. היתרון של גישה זו הוא כי תאי הלה הורית זמינים והוא יכול לשמש כפקד שלילי עבור הספציפיות. גישה כזו כבר אומת עם תאים cho-CD22 לעומת צ’ו ו-CHO-BCMAs vs. צ’ו תאים29. באמצעות גישות שונות כאלה, מכונית T-cell עיצוב ויעילות ניתן לבדוק בקלות. הxCELLigence הוא גמיש באופן מיסודו, וניתן לכוונן תנאי שינוי כדי להגיע לתנאים פיזיולוגיים משוערים.
אחד היתרונות העיקריים של שיטת העוצמה שתיארנו כאן הוא שזהו מינון פונקציונלי פשוט וניתן להשתמש בו בשילוב עם טכניקות הנדסיות גנטיות לתכנון מכוניות אופטימליות ומיטביות בצורה של תפוקה גבוהה. כפי שמוצג כאן עבור תאים T רכב שנועד למקד את התאים הסרטניים EGFR-חיובית, הבקשה ניתן להשתמש כדי להעריך את הפעילות היחסית של בנייה רכב שונים/מוטציות. לדוגמה, הצגנו כי כאשר מתחם ה-, ממוקם במעלה הזרם של התחום CD3, הוא מראה פעילות cytolytic חזקה הרבה יותר מאשר כאשר הוא נמצא במורד הזרם של התחום CD3.
למרות שזה לא מתאם באופן מושלם עם פעילות תא T vivo CAR, בשחרור מחוץ לבית השימוש מבחינה גופית יש היסטורית משמש כמדד של מכונית T לעוצמת תא. למרות שהיעילות המבוססת על xCELLigence מתוארת כאן יכולה לשמש להערכת טיפולים מבוססי תא במהלך הייצור או לפני שפורסמו עבור יישום קליני, כמה טוב התוצאות הללו לתאם עם vivo יעילותם עדיין לא וקמה. בvivo היעילות תלויה במגוון גורמים ומשתנים שאינם מובנים מראש בתוך שיטת חוץ גופית. משתנים כאלה כוללים: הביות של תאי T רכב לאתר של הגידול, גירוי והפעלה של תא T רכב ויכולתה להתמיד בתוך המטופל, ואת מיקרוסביבה הגידול. עם עידון נוסף הxCELLigence מסוגל לדגמן חלק מתהליכים מורכבים אלה בתוך מבחנה.
הפרוטוקול המסופק כאן חל על מרבית התאים של סרטן מחסיד וחלק קווי הגידול נוזלי. דגימות קליניות כגון תאים סרטניים ראשוני, עם זאת, צריך להיות נבדק ואופטימיזציה יותר בשל המורכבות של סוגי הגידול והשלבים. זה בהחלט שווה לציין כי מערכת שיטת האנרגיה מחוץ למערכת תיאר כאן משתמשת שורות תאים סרטניים רק כדי לשקף את הפעילות הפוטנציאלית של תאי T רכב. המצב הגידול האמיתי בתוך הגוף האנושי הוא הרבה יותר מורכב, במיוחד כאשר גידול מוצק מכוון, בשל סביבת הגידול הדינמי ופיתוח. לכן, תוצאת הערכת העוצמה לא יכול לתרגם היטב את היעילות הקלינית של תאי T רכב נבדק.
לסיכום, המוצג מבוסס עכבה פלטפורמת xCELLigence מאפשר ניטור ללא תווית של הריגת תאים לתקופה ממושכת של זמן, כלומר עד 10 ימים. קיבולת זו עבור קנה מידה ארוך כל כך של איסוף נתונים מבדיל את הטכנולוגיה מתנאי אחר הנמצאים כעת בשימוש והדורשים הגדרת משכפל ניסיוני מרובים עבור אוסף נקודות זמן ותפעול לדוגמה מפרך. יתר על כן, התרומה אות מינימלית של התאים החיסוניים של האפקטור מפשט את ניתוח הנתונים. התוכנה יכולה לעבד נתונים באופן אוטומטי וליצור פרמטרים שימושיים כגון אחוז cytolysis, KT50, וכו ‘. הטכנולוגיה כבר הוכיחה רגישות גבוהה (עם יחסי E:T נמוך כמו 1:20) וטווח דינמי גדול (עם יחס E:T מ 20:1 ל 1:20), אשר לא ניתן להשיג בקלות עם assays אחרים. בסך הכל, היישום של טכנולוגיה זו צריך לאפשר ניתוח נתונים מדויק יותר בקנה מידה גבוה יותר שישפר את ההתפתחות של ריאגנטים T-cell מכונית, לקדם את השדה בקצב גבוה הרבה יותר.
The authors have nothing to disclose.
המחברים מודים ProMab Biotechnologies ו ביוטכנולוגיה ביולוגית עבור מתן ריאגנטים וכלים מנוצל במחקר זה.
7-AAD | Biolegend | 420404 | |
Anti-CD40, liquid tumor killing assay kit | ACEA Biosciences | 8100005 | |
anti-human F(ab')2 | Jackson Immunoresearch laboratories. | 109-116-088 | |
APC anti-CD3 | Biolegend | 317318 | |
Assay medium RPMI1640 | life technologies.Corp | 11875-093 | |
CAR-T cell frozen solution CryostorCS10 | Stemcell technologies | #07930 | |
CAR-T cell medium from ProMab | AIM-V+300IFU/ml IL-2 | 12055-091 | |
CD3/CD28 coated microbeads, Dynabeads | Thermofisher | 11131D | |
DMEM | GElifesciences.com | SH30243.02 | |
FACS buffer | Promab made | ||
FBS | Lonza.com | 14-503F | |
HEK293FT | Thermo Fisher | R70007 | |
INFg ELISA kit | Thermo Fisher | ||
Lentiviral Packaging Mix | System Biosciences | VP100 | |
Lenti-X quantitative RT-PCR titration kit (Clontech) | Takara | 631235 | |
Promab medium for target cells | Varied with cell lines | ||
Real time Cellular Analyer | ACEA Biosciences | ||
Thermal cycler | Thermo Fisher | ||
Transduction enhance agent, Virus Transduction Enhancer (Alstem) | Transplus, Alstem | V020 | |
Transfection dilution solution, Opti-MEM | Thermo Fisher | ||
Transfection reagent, NanoFect reagent | Alstem | NF100 |