Descrevemos um sistema quantitativo de ensaio de citolíse in vitro em tempo real para avaliar a potência das células T do receptor de antígeno quimérico que visam células tumorais líquidas e sólidas. Este protocolo pode ser estendido para avaliar outras células efetores imunes, bem como tratamentos combinados.
A terapia com células T do receptor de antígeno quimérico (CAR) para o câncer alcançou benefícios clínicos significativos para neoplasias hematológicas resistentes e refratárias, como leucemia linfócito aguda infantil. Esforços estão em andamento para estender essa terapia promissora para tumores sólidos, além de outros cânceres hematológicos. Aqui, descrevemos o desenvolvimento e a produção de potentes células T CAR visando antígenos com expressão única ou preferencial em células tumorais sólidas e líquidas. A potência in vitro dessas células T CAR é então avaliada em tempo real usando o ensaio xCELLigence altamente sensível à base de impedância. Especificamente, o impacto de diferentes domínios de sinalização costimulatória, como a proteína relacionada ao receptor de necrose tumoral induzida por glicocorticoide (TNFR) (GITR), sobre a potência in vitro das células T CAR é examinada. Este relatório inclui protocolos para: geração de células T CAR para estudos pré-clínicos usando transdução de genes lentivirais, expansão das células T CAR, validando a expressão do CAR e executando e analisando ensaios de potência xCELLigence.
Nos últimos anos, a terapia com células T da RCA tem sido um dos avanços mais proeminentes na imunoterapia do câncer para neoplasias hematopoiéticas reincidentes e refratárias. Com os eua recentes Food and Drug Administration (FDA) aprovação de células T CAR dirigidas por CD19 para leucemia linfoblástica aguda, linfoma não Hodgkin e linfoma difuso de grandes células B, e a designação de terapia inovadora para antígeno de maturação de células B (BCMA) dirigiu células T de CARRO para mieloma múltiplo, esta tecnologia gerou grande excitação na comunidade científica e tem alimentado inúmeros estudos básicos, aplicados e clínicos em todo o mundo1, 2,3, 3, 3,3, 3, 3, 3, 3, 3, 3, 3, 3, 3, 3, 3, 3, 3, 3, 3, 3, 3, 3, 3, 3, 3, 3, 3, 3, 3, 3, 3, 3, 3, 3, 3, 3, 3, 3, 3 de ensino básico e clínico alimentaram inúmeros estudos básicos, aplicados e clínicos em todo o mundo1,2,3, 3 4,5. Em janeiro de 2019, mais de 700 ensaios clínicos foram registrados no banco de dados de ensaios clínicos (clinicaltrials.gov); cerca de 450 desses ensaios estavam prestes a começar ou estavam recrutando ativamente pacientes. A maioria dos ensaios clínicos estão focados em neoplasias hematológicas, e ensaios clínicos utilizando células T CAR visando CD20, CD22 e BCMAs, além de CD19, estão emcurso,bem como6,7. Enquanto a maioria dos ensaios estão usando a terapia autologous CAR Células T, um número significativo deles também estão explorando a utilidade das células T do CARRO alogênico8,9,10. Apesar dos resultados promissores com malignidades hematológicas, o uso de células T CAR para atingir tumores sólidos tem se mostrado muito mais difícil na clínica por uma variedade de razões, incluindo, mas não se limitando à falta de bons alvos que são expressos exclusivamente no tumor, a heterogeneidade de tumores sólidos e tumor “escape”, e a dificuldade que as células CAR T têm em acessar o microambiente tumoral 11 ,12,13 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , e a dificuldade que as células CAR T têm em acessar o microambiente tumoral 11 , 12 , 13 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , ea dificuldade que as células CAR T têm em acessar o microambiente tumoral 11 , 12 , 13 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , ea dificuldade que as células CAR T têm em acessar o microambiente tumoral11,12,13 , 14,14, 15.Há uma necessidade crítica para o desenvolvimento de células T CAR específicas de tumor estoirização sólidaque podem superar essas barreiras à eficácia e ao problema da toxicidade “no tumor alvo”. Enquanto uma infinidade de abordagens in vitro e in vivo são justificadas no projeto e teste de células T CAR, um ensaio de potência in vitro robusto e preditivo é de importância primária16,17.
A fim de avaliar a potência das células T CAR, vários métodos in vitro foram desenvolvidos. Em geral, esses ensaios de potência podem ser divididos em duas categorias amplas, dependendo se eles(i)medir diretamente a atividade ctolítica das células T CAR contra células tumorais alvo, ou (ii)medir marcadores substitutos, como citocinas que são liberados pelas células T CAR como eles matam as células-alvo. Técnicas que medem a atividade citolítica diretamente incluem o ensaio de liberação cromo-51 (CRA)18,ensaios baseados em imagens que medem a apoptose de células-alvo usando sondas fluorescentes19,20,e ensaios de citometria de fluxo que detectam células-alvo apoptotéticas21. Nestes ensaios, as células T CAR são tipicamente co-cultivadas com células-alvo que foram pré-rotuladas com sondas radioativas ou fluorescentes, seguidas de medição adequada. Embora tenha sido considerado o padrão ouro no campo devido à sua sensibilidade, o CRA tem algumas desvantagens. Primeiro, é um ensaio de ponto final e não fornece informações cinéticas. Em segundo lugar, as células-alvo precisam ser rotuladas com cromo-51, que tende a lixiviar para fora das células e pode aumentar significativamente o ruído de fundo22. Por último, exige as devidas precauções e a eliminação dos resíduos radioactivos. Ensaios alternativos, que medem subprodutos da interação com células T do CAR com células-alvo como uma indicação de potência, incluem a quantidade de várias citocinas liberadas pelas células T CAR usando métodos baseados em citometria de fluxo ou ensaios imunosordobrados ligados a enzimas. Mais uma vez, estes são ensaios de ponto final que medem a liberação cumulativa das citocinas em um determinado ponto de tempo e, portanto, podem não refletir necessariamente a atividade citolítica real das células T CAR.
Ao desenvolver um ensaio de potência, particularmente aquele que define os critérios de liberação para uma terapia baseada em células, como uma célula T car, é fundamental que o ensaio envolva manipulações mínimas e tempo prático porque cada interação é outra variável que precisa ser contabilizada e pode diminuir a robustez geral e a consistência do ensaio. Além disso, a interação das células T CAR com as células tumorais é um processo dinâmico, e fornecer informações sobre essas interações dinâmicas, como a taxa de citocise, é de importância primordial para a avaliação da potência. Com esses critérios em mente, desenvolvemos um ensaio de potência cinética sem rótulopara células T CAR que utiliza a plataforma de análise de células em tempo real xCELLigence (RTCA). a xCELLigence utiliza placas especializadas de microtiter (Placas E) que contêm biossensores de ouro embutidos na parte inferior de cada poço. Trabalhando com células tumorais sólidas aderentes, ou células cancerosas líquidas que foram amarradas usando anticorpos específicos, esses biossensores monitoram em mudanças induzidas por células T em tempo real no número de células-alvo, tamanho celular, força de fixação de substrato celular e interações células celulares (ou seja, função de barreira)17,23,24,25,27,28. O fluxo de trabalho é simples e envolve simplesmente semeadura das células-alvo para os poços de Placas-E, seguido pela adição das células T CAR em diferentes proporções efeteror-a-alvo (Figura 1). Posteriormente, à medida que os biossensores monitoram continuamente a viabilidade das células-alvo, os dados são automaticamente exibidos em tempo real.
Nos últimos 15 anos, o ensaio xCELLigence foi validado para avaliar a potência das células assassinas naturais (NK), células T, células T CAR, inibidores de checkpoint, anticorpos biespecíficos, vírus oncolíticos e algumas terapias combinadas17,29,30,31,32,33,34. Recentemente, o ensaio de potência xCELLigence foi avaliado para a fabricação de células T projetadas por células T35. Aqui relatamos empregar o sistema RTCA para avaliar a potência in vitro das células T CAR projetadas para atingir tumores sólidos e tumores líquidos em terapias clínicas.
Os receptores de antígeno quimérico são proteínas multidomínio compostas por um fragmento variável de cadeia única extracelular (região scFv), uma região de dobradiça, uma região de transmembrana e um domínio citoplasmacomico composto por domínios de sinalização tcr e domínios costimulatórios adicionais de receptores como CD28 e OX4011,40. Para projetar CARs seguros, seletivos e eficazes, é imperativo que as várias permutações no projeto dos CARs sejam completamente testadas usando ensaios de potência in vitro e, eventualmente, modelos animais. Neste estudo, nós fornecemos um protocolo e um fluxo de trabalho de como um ensaio de potência in vitro em tempo real pode informar o projeto de CARs eficazes.
Na concepção de qualquer tipo de ensaio de potência, particularmente para fins de fabricação, é imperativo que o ensaio seja sensível, robusto, consistente e o mais próximo possível do mecanismo de ação16,17,41. O ensaio de potência em tempo real descrito aqui é projetado para medir a atividade citolítica da célula T CAR diretamente ao invés de usar um marcador substituto, como a liberação de citocina. Importante, o ensaio não requer quaisquer componentes adicionais, tais como corantes ou reagentes que não seja a placa de ensaio (E-Plate) e os meios de comunicação recomendados para a manutenção das células. Além disso, o ensaio é extremamente sensível e fornece dados altamente reproduzíveis em comparação com outros ensaios baseados emrótulo42,43,44. Além disso, o ensaio xCELLigence é passível de usar proporções efetuais muito baixas de efetora-alvo, o que é ideal para a avaliação de citolise específica.
A fim de demonstrar a flexibilidade e utilidade do sistema xCELLigence, temos focado em dois tipos de tumores, ou seja, tumores de origem hematológica e tumores sólidos. A fim de avaliar a potência das células T CAR dirigidas por CD22, as células Raji (ou seja, uma linha de células de linfoma de células B) foram amarradas às Placas E usando um anticorpo anti-CD40. O tethering de pilhas de Raji à parte inferior das E-placas conduz a um sinal da impedância que reflita a viabilidade e o número de pilhas de Raji no poço. Após a adição de células T CD22-CAR, as células Raji são seletivamente mortas de forma dependente de tempo e efetiva, culminando em uma diminuição dependente do tempo no sinal de impedância. A queda na impedância significa citolyse ou perda de viabilidade das células Raji17. Esta aproximação seletiva do tethering usando anticorpos pode ser estendida a outras linhas líquidas da pilha do tumor. Uma estratégia alternativa ao uso de linhas celulares tumorais de origem hematológica é usar células cancerosas aderentes que são projetadas para expressar de forma evigorada os antígenos tumorais, como cd19 expressa em células HeLa. A vantagem desta abordagem é que as células hela parentais estão prontamente disponíveis e podem ser usadas como um controle negativo para especificidade. Tal abordagem já foi validada com células CHO-CD22 vs. CHO e células CHO-BCMAs vs. células CHO29. Usando tais aproximações diferentes, o projeto e a eficácia da T-pilha do CARRO podem facilmente ser testados. O ensaio xCELLigence é inerentemente flexível, e as condições de ensaio podem ser ajustadas para aproximar-se de condições fisiológicas.
Uma grande vantagem do ensaio de potência que descrevimos aqui é que é um ensaio funcional simples e pode ser usado em conjunto com técnicas de engenharia genética para projetar CARs ideais e eficazes de forma de alta produtividade. Como foi mostrado aqui para células T CAR projetadas para atingir células cancerosas EGFR-positivas, o ensaio pode ser usado para avaliar a atividade relativa de diferentes construções/mutantes de CAR. Por exemplo, mostramos que, quando o domínio GITR está localizado a montante do domínio CD3, ele mostra uma atividade citolítica muito mais robusta do que quando está localizado a jusante do domínio CD3.
Embora não se correlacione perfeitamente com a atividade in vivo da pilha de T do CARRO, a liberação in vitro da citocina foi usada historicamente como uma medida da potência da pilha de T do CARRO. Embora o ensaio de potência baseado em xCELLigence descrito aqui possa ser usado para avaliar terapias à base de células durante a fabricação ou antes de ser liberado para aplicação clínica, o quão bem esses resultados se correlacionam com a eficácia in vivo ainda não foi Estabelecido. A eficácia in vivo depende de uma série de fatores e variáveis que podem não ser recapitulados dentro de um ensaio in vitro. Tais variáveis incluem: homing das pilhas de T do CAR ao local do tumor, a estimulação e a ativação da pilha de T do CAR e sua habilidade de persistir dentro do paciente, e do microenvironment do tumor. Com mais refinamento, o ensaio xCELLigence pode ser capaz de modelar alguns desses processos complexos in vitro.
O protocolo fornecido aqui aplica-se à maioria das linhas de células cancerosas aderentes e algumas das linhas de células tumorais líquidas. Amostras clínicas, como células cancerosas primárias, no entanto, precisam ser testadas e otimizadas devido à complexidade dos tipos e fases tumorais. É certamente digno de nota que o sistema de ensaio de potência in vitro descrito aqui usa linhas de células cancerosas apenas para refletir a atividade potencial das células T CAR. A situação real do tumor dentro do corpo humano é muito mais complexa, especial quando um tumor contínuo é alvejado, devido ao ambiente e ao desenvolvimento dinâmicos do tumor. Portanto, o resultado da avaliação de potência pode não se traduzir muito bem na eficácia clínica das células T CAR testadas.
Em resumo, a plataforma xCELLigence baseada em impedância apresentada permite o monitoramento sem rótulos de matança celular por um longo período de tempo, ou seja, até 10 dias. Essa capacidade de uma escala temporal tão longa para coleta de dados diferencia a tecnologia de outros ensaios que estão atualmente em uso e que exigem a criação de múltiplas réplicas experimentais para coleta de pontos de tempo e manipulação laboriosa de amostras. Além disso, a contribuição mínima do sinal das células imunes efetoras simplifica a análise de dados. O software pode processar dados automaticamente e gerar parâmetros úteis, como a porcentagem de citolíse, KT50, etc. A tecnologia já demonstrou alta sensibilidade (com proporções De:T tão baixas quanto 1:20) e uma grande faixa dinâmica (com proporções de E:T de 20:1 para 1:20), o que não é facilmente alcançado com outros ensaios. Em geral, a implementação dessa tecnologia deve permitir uma análise de dados mais precisa em uma escala de taxa de transferência mais alta que irá melhorar o desenvolvimento de reagentes de células T da RCA, avançando o campo em um ritmo muito maior.
The authors have nothing to disclose.
Os autores agradecem à ProMab Biotechnologies e à ACEA Biosciences por fornecer os reagentes e instrumentos utilizados neste estudo.
7-AAD | Biolegend | 420404 | |
Anti-CD40, liquid tumor killing assay kit | ACEA Biosciences | 8100005 | |
anti-human F(ab')2 | Jackson Immunoresearch laboratories. | 109-116-088 | |
APC anti-CD3 | Biolegend | 317318 | |
Assay medium RPMI1640 | life technologies.Corp | 11875-093 | |
CAR-T cell frozen solution CryostorCS10 | Stemcell technologies | #07930 | |
CAR-T cell medium from ProMab | AIM-V+300IFU/ml IL-2 | 12055-091 | |
CD3/CD28 coated microbeads, Dynabeads | Thermofisher | 11131D | |
DMEM | GElifesciences.com | SH30243.02 | |
FACS buffer | Promab made | ||
FBS | Lonza.com | 14-503F | |
HEK293FT | Thermo Fisher | R70007 | |
INFg ELISA kit | Thermo Fisher | ||
Lentiviral Packaging Mix | System Biosciences | VP100 | |
Lenti-X quantitative RT-PCR titration kit (Clontech) | Takara | 631235 | |
Promab medium for target cells | Varied with cell lines | ||
Real time Cellular Analyer | ACEA Biosciences | ||
Thermal cycler | Thermo Fisher | ||
Transduction enhance agent, Virus Transduction Enhancer (Alstem) | Transplus, Alstem | V020 | |
Transfection dilution solution, Opti-MEM | Thermo Fisher | ||
Transfection reagent, NanoFect reagent | Alstem | NF100 |