We beschrijven een kwantitatieve real-time in vitro cytolysis assay systeem om de potentie van chimere antigeen receptor T-cellen gericht op vloeibare en solide tumorcellen te evalueren. Dit protocol kan worden uitgebreid om andere immuuneffector cellen te beoordelen, evenals combinatie behandelingen.
Chimeric antigeen receptor (auto) T-cel therapie voor kanker heeft significant klinisch voordeel bereikt voor resistente en refractaire hematologische maligniteiten zoals jeugd acute lymfatische leukemie. Inspanningen zijn momenteel aan de gang om deze veelbelovende therapie te verlengen tot solide tumoren naast andere hematologische kankers. Hier beschrijven we de ontwikkeling en productie van potente auto T-cellen gericht op antigenen met unieke of preferentiële uitdrukking op vaste en vloeibare tumorcellen. De in vitro potentie van deze auto T-cellen wordt vervolgens in real-time geëvalueerd met behulp van de zeer gevoelige, op impedantie gebaseerde xCELLigence test. Specifiek, de impact van verschillende costimulatory signalering domeinen, zoals Glucocorticoïde-geïnduceerde tumor necrose factor receptor (TNFR)-gerelateerde eiwitten (GITR), op de in vitro potentie van auto T cellen wordt onderzocht. Dit rapport bevat protocollen voor: het genereren van auto T-cellen voor preklinische studies met behulp van lentivirale gen-transductie, het uitbreiden van auto T-cellen, het valideren van de auto-expressie en het uitvoeren en analyseren van xCELLigence potentie-assays.
In de afgelopen jaren, auto T-cel therapie is een van de meest prominente doorbraken in kanker immunotherapie voor gerecidiveerd en refractaire hematopoietische maligniteiten. Met de recente Amerikaanse Food and Drug Administration (FDA) goedkeuring van CD19-gestuurde auto T cellen voor acute lymfoblastische leukemie, niet-Hodgkin lymfoom, en diffuus groot B-cellymfoom, en de aanwijzing van doorbraak therapie voor B-celmaturatie antigeen (bcma)-geleide auto T-cellen voor multipel myeloom, deze technologie heeft grote opwinding in de wetenschappelijke gemeenschap gegenereerd en heeft talrijke basis, toegepaste en klinische studies wereldwijd1,2,3, 4,5. In januari van 2019 werden meer dan 700 klinische studies geregistreerd in de database van de klinische proef (clinicaltrials.gov); ongeveer 450 van deze studies waren ofwel begonnen of actief rekruteren van patiënten. Het merendeel van de klinische proeven zijn gericht op hematologische maligniteiten, en klinische proeven met behulp van auto T-cellen gericht op CD20, CD22, en bcmas, naast CD19, zijn lopende als goed6,7. Terwijl de meeste van de proeven zijn met behulp van autologe auto t-cel therapie, een groot aantal van hen zijn ook het verkennen van het nut van allogene auto t-cellen8,9,10. Ondanks veelbelovende resultaten met hematologische maligniteiten, het gebruik van auto T cellen te richten op solide tumoren is gebleken dat veel moeilijker in de kliniek om een verscheidenheid van redenen, met inbegrip van maar niet beperkt tot het ontbreken van goede doelen die uitsluitend worden uitgedrukt in de tumor, de heterogeniteit van solide tumoren en tumor “ontsnappen”, en de moeilijkheid die auto T cellen hebben in de toegang tot de tumor micro omgeving11,12,13,14, 15. er is een kritieke behoefte aan de ontwikkeling van solide tumor-specifieke auto T-cellen die deze belemmeringen voor de werkzaamheid en het probleem van “op doel-off tumor” toxiciteit kunnen overwinnen. Hoewel een veelheid van in vitro en in vivo benaderingen gerechtvaardigd zijn in het ontwerp en testen van auto T-cellen, is een robuuste en voorspellende in vitro potentie test van primair belang16,17.
Om de potentie van auto T-cellen te beoordelen, zijn verschillende in vitro-methoden ontwikkeld. Over het algemeen kunnen deze potentie-assays worden onderverdeeld in twee brede categorieën, afhankelijk van of ze (i) direct de cytolytische activiteit van auto-t-cellen tegen doel tumorcellen meten, of (II) surrogaat markeringen zoals cytokines die door de auto t-cellen worden vrijgegeven als ze de doelcellen doden. Technieken die cytolytische activiteit direct meten omvatten de chromium-51 release assay (CRA)18, op Imaging gebaseerde assays die apoptosis van doelcellen meten met behulp van fluorescentie sondes19,20, en Flowcytometrie assays die apoptotic doelcellen detecteren21. In deze testen worden auto-T-cellen meestal medegekweekt met doelcellen die vooraf zijn gelabeld met radioactieve of fluorescerende sondes, gevolgd door een passende meting. Hoewel het al lange tijd beschouwd als de gouden standaard in het veld vanwege de gevoeligheid, de CRA heeft een aantal nadelen. Ten eerste is het een eindpunt test en geeft het geen kinetische informatie. Ten tweede moeten de doelcellen worden gelabeld met chromium-51 die de neiging heeft om uit de cellen te Leach en de achtergrondruis22aanzienlijk kan verhogen. Tot slot zijn er goede voorzorgsmaatregelen en verwijdering van het radioactieve afval nodig. Alternatieve assays, die bijproducten van de auto T-cel interactie met doelcellen als een indicatie van de potentie meten, omvatten de kwantatie van verschillende cytokines vrijgegeven door auto T cellen met behulp van ofwel flow cytometrie gebaseerde methoden of enzym-gebonden immunosorbent assays. Nogmaals, dit zijn endpoint assays die de cumulatieve afgifte van de cytokines op een bepaald tijdstip meten en dus mogelijk niet noodzakelijkerwijs de feitelijke cytolytische activiteit van de auto T-cellen weerspiegelen.
Bij het ontwikkelen van een potentie test, met name een die de vrijgave criteria voor een cel-gebaseerde therapie zoals een auto T-cel definieert, is het van cruciaal belang dat de assay minimale manipulaties en hands-on tijd omvat, omdat elke interactie een andere variabele is die moet worden verantwoord en de algehele robuustheid en consistentie van de assay kan verminderen. Bovendien, de interactie van de auto T cellen met de tumorcellen is een dynamisch proces, en het verstrekken van informatie over deze dynamische interacties, zoals de snelheid van cytolysis, is van primair belang voor de potentie evaluatie. Met deze criteria in gedachten ontwikkelden we een label vrije kinetische potentie test voor auto T-cellen die gebruikmaakt van het RTCA-platform (real-time Cell Analysis) van xCELLigence. xCELLigence maakt gebruik van gespecialiseerde microtiterplaten (E-plates) die gouden biosensoren ingebed in de bodem van elke put bevatten. Werken met ofwel aanhandende solide tumorcellen, of vloeibare kankercellen die zijn getethering met behulp van specifieke antilichamen, deze biosensoren bewaken in real-time auto T-cel-geïnduceerde veranderingen in het doelcel nummer, celgrootte, celsubstraat gehechtheid sterkte, en celcelinteracties (d.w.z. barrièrefunctie)17,23,24,25,26,27,28. De workflow is eenvoudig en omvat het simpelweg zaaien van de doelcellen in de putjes van E-Plates, gevolgd door de toevoeging van de auto T-cellen aan verschillende Effector-to-target verhoudingen (Figuur 1). Naarmate de biosensoren continu de levensvatbaarheid van de doelcellen bewaken, worden de gegevens automatisch in real-time weergegeven.
In de afgelopen 15 jaar is de xcelligence test gevalideerd voor het beoordelen van de potentie van Natural Killer (NK) cellen, t-cellen, auto t-cellen, controlepunt remmers, bispecifieke antilichamen, oncolytische virussen en een aantal combinatietherapieën17,29,30,31,32,33,34. Onlangs werd de xCELLigence potentie test geëvalueerd voor t-cellen die T-cel receptor (TCR) fabriceren35. Hier rapporteren we het gebruik van de RTCA-systeem voor het evalueren van de in vitro potentie van auto T-cellen ontworpen om te richten op solide tumoren en vloeibare tumoren in klinische therapieën.
Chimeric antigeen receptoren zijn multi Domain eiwitten samengesteld uit een extracellulaire single-Chain variabel fragment (scFv regio), een scharnier gebied, een transmembraan regio, en een cytoplasmonisch domein samengesteld uit TCR signalering domeinen en aanvullende costimulatory domeinen van receptoren zoals CD28 en OX4011,40. Om veilige, selectieve en effectieve Auto’s te ontwerpen, is het noodzakelijk dat de verschillende permutaties in het ontwerp van de Auto’s grondig worden getest met behulp van in vitro potentie testen en, uiteindelijk, diermodellen. In deze studie hebben we een protocol en een workflow voorzien voor hoe een real-time in vitro potentie test het ontwerp van effectieve Auto’s kan informeren.
Bij het ontwerpen van elk type potentie test, met name voor productiedoeleinden, is het noodzakelijk dat de test gevoelig, robuust, consistent en zo dicht mogelijk bij het werkingsmechanisme16,17,41is. De hier beschreven real-time potentie test is ontworpen om de cytolytische activiteit van de auto T-cel rechtstreeks te meten in plaats van een surrogaat marker zoals cytokine-afgifte te gebruiken. Belangrijk is dat de assay geen aanvullende componenten zoals kleurstoffen of reagentia vereist, anders dan de test plaat (E-plaat) en de aanbevolen media voor het onderhouden van de cellen. Bovendien is de assay uiterst gevoelig en levert deze zeer reproduceerbare gegevens in vergelijking met andere op een label gebaseerde assays42,43,44. Bovendien is de xCELLigence test vatbaar voor het gebruik van zeer lage Effector-to-target ratio’s die ideaal zijn voor de beoordeling van specifieke cytolyse.
Om de flexibiliteit en nut van het xCELLigence systeem aan te tonen, hebben we ons geconcentreerd op twee tumortypes, namelijk tumoren van hematologische oorsprong en solide tumoren. Om de potentie van CD22-gestuurde auto T-cellen te beoordelen, werden Raji-cellen (d.w.z. een B-cel lymfoom cellijn) aan de E-platen vastgebonden met behulp van een anti-CD40 antilichaam. De Tethering van Raji-cellen tot de bodem van de E-platen resulteert in een impedantie signaal dat de levensvatbaarheid en het aantal Raji-cellen in de put weerspiegelt. Na de toevoeging van CD22-CAR T-cellen worden de Raji-cellen selectief gedood in een tijd-en Effector-afhankelijke manier, wat culmineert in een tijdafhankelijke afname van het impedantie signaal. De daling van de impedantie betekent cytolyse of verlies van levensvatbaarheid van de Raji-cellen17. Deze selectieve Tethering aanpak met antilichamen kan worden uitgebreid naar andere vloeibare tumor cellijnen. Een alternatieve strategie voor het gebruik van tumor cellijnen van hematologische oorsprong is het gebruik van aanhankelijk kankercellen die zijn ontworpen om stabiel uitdrukken de tumor antigenen, zoals CD19 uitgedrukt in HeLa cellen. Het voordeel van deze benadering is dat de cellen van de ouderlijke HeLa direct beschikbaar zijn en kunnen worden gebruikt als een negatieve controle op specificiteit. Een dergelijke aanpak is al gevalideerd met CHO-CD22 vs. Cho-cellen en CHO-BCMAs vs. CHO-cellen29. Met behulp van dergelijke verschillende benaderingen, auto T-cel ontwerp en werkzaamheid kunnen eenvoudig worden getest. De xCELLigence test is inherent flexibel en testcondities kunnen worden aangepast om de fysiologische omstandigheden maximaal te benaderen.
Een groot voordeel van de potentie assay die we hier beschrijven is dat het een eenvoudige functionele assay is en kan worden gebruikt in combinatie met genetische manipulatie technieken om optimale en effectieve Auto’s te ontwerpen op een high-throughput manier. Zoals hier is aangetoond voor auto T-cellen die zijn ontworpen om EGFR-positieve kankercellen te targeten, kan de test worden gebruikt om de relatieve activiteit van verschillende auto constructies/mutanten te evalueren. We hebben bijvoorbeeld laten zien dat wanneer het GITR-domein zich stroomopwaarts bevindt van het domein CD3 het veel robuustere cytolytische activiteit vertoont dan wanneer het zich stroomafwaarts van het CD3 domein bevindt.
Hoewel het niet perfect correleren met in vivo auto T cel activiteit, in vitro cytokine release is historisch gebruikt als een maatstaf voor de potentie van de auto T-cel. Hoewel de hier beschreven xCELLigence-potentie test kan worden gebruikt voor het evalueren van op cellen gebaseerde therapieën tijdens de productie of voordat deze worden vrijgegeven voor klinische toepassingen, is het zo dat deze resultaten correleren met de werkzaamheid in vivo nog niet Vastgesteld. In vivo is de werkzaamheid afhankelijk van een groot aantal factoren en variabelen die niet binnen een in vitro assay kunnen worden samengevat. Dergelijke variabelen omvatten: homing van de auto T cellen op de plaats van de tumor, de stimulatie en activering van de auto T cel en haar vermogen om te blijven binnen de patiënt, en de tumor micro omgeving. Met verdere verfijning kan de xCELLigence test in staat zijn om sommige van deze complexe processen in vitro te modelleren.
Het protocol dat hier wordt toegepast is van toepassing op de meeste aanhangers van kanker cellijnen en sommige van de vloeibare tumor cellijnen. Klinische monsters zoals primaire kankercellen moeten echter verder worden getest en geoptimaliseerd vanwege de complexiteit van de tumortypen en-fasen. Het is zeker vermeldenswaard dat de in vitro potentie assay systeem hier beschreven gebruikt Cancer cellijnen alleen om de potentiële activiteit van de auto T cellen weerspiegelen. De echte tumor situatie in het menselijk lichaam is veel complexer, vooral wanneer een solide tumor is gericht, als gevolg van de dynamische tumor omgeving en ontwikkeling. Daarom kan het resultaat van de potentie-evaluatie niet zeer goed vertalen in de klinische werkzaamheid van de geteste auto T-cellen.
Kortom, het gepresenteerde op impedantie gebaseerde xCELLigence platform maakt het mogelijk om celmoord gedurende langere tijd te controleren, namelijk tot 10 dagen. Deze capaciteit voor zo’n lange temporele schaal voor het verzamelen van gegevens onderscheidt de technologie van andere assays die momenteel in gebruik zijn en waarvoor het instellen van meerdere experimentele replicaten nodig is voor het verzamelen van tijdpunten en het manipuleren van bewerkelijk monsters. Bovendien vereenvoudigt de minimale signaal bijdrage van de Effector immuuncellen data-analyse. De software kan gegevens automatisch verwerken en nuttige parameters genereren, zoals het percentage cytolysis, KT50, enz. De technologie heeft al aangetoond hoge gevoeligheid (met E:T ratio’s zo laag als 1:20) en een groot dynamisch bereik (met E:T verhoudingen van 20:1 tot 1:20), die niet gemakkelijk wordt bereikt met andere testen. Over het algemeen moet de implementatie van deze technologie een nauwkeurigere gegevensanalyse mogelijk maken op een hogere doorvoer schaal die de ontwikkeling van auto-T-celreagentia verbetert, waardoor het veld in een veel hoger tempo wordt ontwikkeld.
The authors have nothing to disclose.
De auteurs bedanken ProMab Biotechnologies en ACEA Biosciences voor het leveren van de reagentia en instrumenten die in deze studie worden gebruikt.
7-AAD | Biolegend | 420404 | |
Anti-CD40, liquid tumor killing assay kit | ACEA Biosciences | 8100005 | |
anti-human F(ab')2 | Jackson Immunoresearch laboratories. | 109-116-088 | |
APC anti-CD3 | Biolegend | 317318 | |
Assay medium RPMI1640 | life technologies.Corp | 11875-093 | |
CAR-T cell frozen solution CryostorCS10 | Stemcell technologies | #07930 | |
CAR-T cell medium from ProMab | AIM-V+300IFU/ml IL-2 | 12055-091 | |
CD3/CD28 coated microbeads, Dynabeads | Thermofisher | 11131D | |
DMEM | GElifesciences.com | SH30243.02 | |
FACS buffer | Promab made | ||
FBS | Lonza.com | 14-503F | |
HEK293FT | Thermo Fisher | R70007 | |
INFg ELISA kit | Thermo Fisher | ||
Lentiviral Packaging Mix | System Biosciences | VP100 | |
Lenti-X quantitative RT-PCR titration kit (Clontech) | Takara | 631235 | |
Promab medium for target cells | Varied with cell lines | ||
Real time Cellular Analyer | ACEA Biosciences | ||
Thermal cycler | Thermo Fisher | ||
Transduction enhance agent, Virus Transduction Enhancer (Alstem) | Transplus, Alstem | V020 | |
Transfection dilution solution, Opti-MEM | Thermo Fisher | ||
Transfection reagent, NanoFect reagent | Alstem | NF100 |