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Immunology and Infection

Un esempio di potenza in tempo reale per le cellule T del recettore dell'antigene chimerico rivolte alle cellule tumorali solide ed ematologiche

Published: November 12, 2019
doi:
10.3791/59033
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1ACEA Biosciences, Inc, 2ProMab Biotechnologies. Inc, 3ACEA Therapeutics

Summary

Descriviamo un sistema quantitativo di analisi della citolisi in vitro in tempo reale per valutare la potenza delle cellule T del recettore dell’antigene chimerico che prendono di mira le cellule tumorali liquide e solide. Questo protocollo può essere esteso per valutare altre cellule echeggiatrici immunitarie, così come i trattamenti combinati.

Abstract

La terapia a cellule T del recettore dell’antigene chimerico (CAR) per il cancro ha ottenuto un significativo beneficio clinico per le neoplasie ematologiche resistenti e refrattarie come la leucemia linfocitica acuta infantile. Sono attualmente in corso sforzi per estendere questa promettente terapia ai tumori solidi oltre ad altri tumori ematologici. Qui, descriviamo lo sviluppo e la produzione di potenti cellule T CAR miranti antigeni con espressione unica o preferenziale sulle cellule tumorali solide e liquide. La potenza in vitro di queste cellule T CAR viene quindi valutata in tempo reale utilizzando l’analisi xCELLigence basata sull’impedimento altamente sensibile. In particolare, viene esaminato l’impatto di diversi domini di segnalazione costimulatorici, come la proteina correlata al fattore di necrosi tumorale indotta da glucocorticoide (TNFR) (GITR), sulla potenza in vitro delle cellule T CAR. Questo rapporto include protocolli per: generare cellule T CAR per studi preclinici utilizzando la trasduzione genica lentivirale, espandere le cellule T CAR, convalidare l’espressione CAR e eseguire e analizzare i saggi di potenza xCELLigence.

Introduction

Negli ultimi anni, la terapia CAR T-cell è stata una delle più importanti scoperte nell’immunoterapia del cancro per neoplasie ematopoietiche refrattarie. Con la recente approvazione della Food and Drug Administration (FDA) degli Stati Uniti di cellule CAR T dirette da CD19 per la leucemia linfoblastica acuta, linfoma non-Hodgkin, e diffuso linfoma a grandi cellule B, e la designazione di una terapia rivoluzionaria per l’antigene CAR t di maturazione delle cellule B (BCMA) diretto CAR T cellule per mieloma multiplo, questa tecnologia ha generato grande entusiasmo nella comunità scientifica e ha alimentato numerosi studi di base, applicati e clinici1,2,3. 4,5. Nel gennaio del 2019, più di 700 studi clinici sono stati registrati nel database delle sperimentazioni cliniche (clinicaltrials.gov); circa 450 di questi studi stavano per iniziare o stavano reclutando attivamente pazienti. La maggior parte degli studi clinici si concentrano sulle neoplasie ematologiche, e gli studi clinici che utilizzano cellule CAR T rivolte CD20, CD22 e BCMA, oltre a CD19, sono in corso anche6,7. Mentre la maggior parte degli studi utilizza la terapia autologa CAR T-cell, un numero significativo di loro stanno anche esplorando l’utilità delle cellule T CAR allogeniche8,9,910. Nonostante i promettenti risultati con le neoplasie ematologiche, l’uso di cellule T CAR per colpire i tumori solidi si è dimostrato molto più difficile in clinica per una serie di motivi, tra cui ma non solo la mancanza di buoni bersagli che si esprimono esclusivamente nel tumore, l’eterogeneità dei tumori solidi e la “fuga” tumorale, e la difficoltà che le cellule CAR T hanno nell’accedere al microambiente tumorale11,12, 14, 14 15.C’è una necessità critica per lo sviluppo di cellule CAR T solide specifiche per il tumore che possono superare queste barriere all’efficacia e il problema della tossicità “sul tumore bersaglio”. Mentre una moltitudine di approcci in vitro e in vivo sono garantiti nella progettazione e test delle cellule CAR T, un saggio di potenza in vitro robusto e predittivo è di primaria importanza16,17.

Al fine di valutare la potenza delle cellule CAR T, sono stati sviluppati vari metodi in vitro. In generale, questi saggi di potenza possono essere suddivisi in due ampie categorie a seconda che (i) misurino direttamente l’attività citolitica delle cellule T CAR rispetto alle cellule tumorali bersaglio, o (ii) misurare marcatori surrogati come le citochine che vengono rilasciate dalle cellule T CAR mentre uccidono le cellule bersaglio. Le tecniche che misurano direttamente l’attività citolitica includono il cromo-51 release assay (CRA)18, i saggi basati sull’imaging che misurano l’apoptosi delle cellule bersaglio utilizzando sonde fluorescenti19,20e i saggi di citometria a flusso che rilevano le cellule bersaglio apoptotiche21. In questi saggi, le cellule T CAR sono tipicamente co-coltivate con cellule bersaglio che sono state pre-etichettate con sonde radioattive o fluorescenti, seguite da una misurazione appropriata. Anche se è stato a lungo considerato il gold standard nel campo a causa della sua sensibilità, la CRA ha alcuni inconvenienti. In primo luogo, è un’espressione finale e non fornisce informazioni cinetiche. In secondo luogo, le cellule bersaglio devono essere etichettate con cromo-51 che tende a lisciviare dalle cellule e può aumentare significativamente il rumore di fondo22. Infine, richiede le dovute precauzioni e lo smaltimento delle scorie radioattive. I saggi alternativi, che misurano i sottoprodotti dell’interazione tra cellule T CAR con le cellule bersaglio come indicazione della potenza, includono la quantificazione di varie citochine rilasciate dalle cellule T della RCA utilizzando metodi basati sulla citometria di flusso o analisi immunosorbena enzimatica-collegate. Ancora una volta, questi sono saggi endpoint che misurano il rilascio cumulativo delle citochine in un dato momento e, quindi, potrebbero non riflettere necessariamente l’effettiva attività citolitica delle cellule CAR T.

Quando si sviluppa un asino di potenza, in particolare uno che definisce i criteri di rilascio per una terapia a base di cellule come una cellula T CAR, è fondamentale che l’analisi comporti manipolazioni minime e tempo pratico perché ogni interazione è un’altra variabile che deve essere contabilizzata e può diminuire la robustezza complessiva e la coerenza del saggio. Inoltre, l’interazione delle cellule T CAR con le cellule tumorali è un processo dinamico, e fornire informazioni su queste interazioni dinamiche, come il tasso di citolisi, è di primaria importanza per la valutazione della potenza. Tenendo conto di questi criteri, abbiamo sviluppato un saggio di potenza cinetica senza etichette per le cellule CAR T che utilizza la piattaforma di analisi delle celle in tempo reale (RTCA) xCELLigence. xCELLigence utilizza piastre di microtitolazione specializzate (E-Plates) che contengono biosensori d’oro incorporati nella parte inferiore di ogni pozzo. Lavorando con cellule tumorali solide aderenti, o cellule tumorali liquide che sono state legate utilizzando anticorpi specifici, questi biosensori monitorano in tempo reale i cambiamenti indotti dalle cellule CAR T nel numero di cellule bersaglio, nella dimensione delle cellule, nella forza dell’attacco al substrato cellulare e nelle interazioni tra cellule e cellule (cioè funzione barriera)17,23,24,25,26,27,28. Il flusso di lavoro è semplice e prevede semplicemente il seeding delle celle di destinazione nei pozzi di E-Plates, seguito dall’aggiunta delle cellule T CAR a diversi rapporti effettore-bersaglio (Figura 1). Successivamente, poiché i biosensori monitorano continuamente la fattibilità delle cellule bersaglio, i dati vengono visualizzati automaticamente in tempo reale.

Negli ultimi 15 anni il saggio xCELLigence è stato convalidato per valutare la potenza delle cellule killer naturali (NK), cellule T, cellule T CAR, inibitori del checkpoint, anticorpi bispecifici, virus oncolitici, e alcune terapie di combinazione17,29,30,31,32,33,34. Recentemente, il saggio di potenza xCELLigence è stato valutato per la produzione di cellule T-cell (TCR)-ingegnerizzateT-cell 35. Qui riportiamo l’impiego del sistema RTCA per valutare la potenza in vitro delle cellule CAR T progettate per colpire tumori solidi e tumori liquidi nelle terapie cliniche.

Protocol

1. Generazione di lentivirus con codifica CAR NOTA: Una volta completata la specifica costruzione della plasmiera a cellule T CAR (CD47 e altri), i CAT lentivirali vengono generati dalla procedura standard, utilizzando 293 cellule FT, un mix di imballaggi lentivirali e agenti di trasfezione (vedi Tabella dei materiali) come descritto29. Successivamente, utilizzare un kit quantitativa di reazione a catena di polimerasi di trascrizione inversa (RT-PCR) e un ciclista termico (vedi tabella dei materiali) per determinare il timore del virus misurando la quantità di RNA lentivirale in base al protocollo del produttore. È importante che tutte le procedure lentivirali siano eseguite rigorosamente seguendo i requisiti di sicurezza. Seme 15 x 106 cellule HEK293FT nel mezzo modificato dell’Aquila di Dulbecco (DMEM) e incubare le cellule durante la notte a 37 gradi centigradi in un piatto da 150 mm all’interno di un’incubatrice di CO2 umido del 5%. Preparare due tubi da 15 mL con complesso di trasfezione. Il primo tubo contiene DNA plasmide vettoriale lentivirale (5 g) e mix di imballaggi lentivirali (22,5 g) in 2,5 mL di soluzione di diluizione della trasfezione. Il secondo tubo contiene 82,5 l di reagente di trasfezione in 2,5 mL di soluzione di diluizione della trasfezione (vedere la Tabella dei Materiali). Pipet il contenuto del tubo 1 nel tubo 2, e incubare la miscela a temperatura ambiente per 15 min. Trasferire il contenuto del tubo dropwise al piatto delle cellule HEK293FT e incubare il campione durante la notte a 37 gradi centigradi in un incubatore umido 5% CO2. Il giorno successivo, sostituire il mezzo esistente con 19 mL di fresco mezzo di coltura DMEM e continuare a incubare le cellule durante la notte all’interno dell’incubatore umido 5% CO2 a 37 . Trasferire il mezzo dal piatto a un tubo di centrifuga di 50 mL. Tenere il tubo con il mezzo contenente virus in frigorifero. Ripetere la procedura di cui sopra, aggiungendo dMEM fresco e raccogliendolo di nuovo dopo 1 giorno. Combina due collezioni di supporti in un unico tubo di centrifugazione. Centrifugate il tubo a 2.000 x g per 30 min a 4 gradi centigradi. Trasferire la maggior parte del supernatante contenente lentivirus in un tubo di centrifuga ultrachiaro. Lasciare un volume minimo, circa 1 mL, del supernatore per evitare di disturbare il pellet che può contenere cellule e/o detriti. Ultracentrifuga il super-natant di cui sopra ha chiarito a 110.000 x g per 100 min a 4 gradi centigradi. Rimuovere con attenzione il supernatante e aggiungere delicatamente 100 L di Mezzo DMEM al pellet di virus sul fondo del tubo. Lasciare il tubo sul ghiaccio per 15 min. Conservare questi tubi di riserva del virus in un congelatore da -80 gradi centigradi. Utilizzare un kit quantitativo RT-PCR per determinare il tito del lentivirus secondo il protocollo del produttore, che estrae e misura l’RNA lentivirale. 2. Generazione ed espansione di cellule T CAR Attivare i PbMCP umani precedentemente congelati (circa 1 x 106 a 2 x 106 cellule) in 1 mL di mezzo a celle T CAR con un numero uguale di microsfere rivestite CD3/CD28 (si veda la Tabella dei Materiali)e incubare le cellule a 37 gradi centigradi in un incubatore umido 5% di CO2 per 24 h. Scongelare una aliquota dello stock di lentivirus sul ghiaccio. Aggiungere 1 -L di trasduzione migliorare l’agente nel pozzo con le cellule e mescolare. Aggiungere il lentivirus alle cellule ad una molteplicità di infezione (MOI) di 5:1 e mescolare delicatamente. Il giorno successivo, ripetere questo passaggio (24 h dopo la prima trasduzione). Monitorare la crescita delle cellule T ogni 2-3 giorni. Aggiungere più nuovo CAR T-cell medio per mantenere le cellule ad una densità di 1 x 106 a 2 x 106 cellule / mL. Congelare le celle CAR T con un protocollo standard utilizzando la soluzione di congelamento (vedere la Tabella dei materiali). Scongelare le cellule CAR T utilizzando un metodo standard e precoltura loro nel mezzo cellaT CAR per circa 2-4 h con IL-2 (300 unità / mL) prima di applicarle al saggio. 3. Rilevamento dell’espressione CAR per citometria di flusso Trasferire 3 x 105 cellule T CAR e cellule T non transdotte in due tubi di microcentrifuga da 1,5 mL separati. Centrifugare i tubi a 300 x g per 2 min e risospendere le cellule in 200 – L di fluorescenza-attivato tampone cellulare (FACS) contenente 1% siero umano. Tubo 100 L di soluzione cellulare in due tubi FACS in polistirolo da 5 ml e tenere i tubi sul ghiaccio per 5 min. Aggiungere 1 -L di capra biotinylata anti-topo F(ab’)2 a un tubo di ogni tipo di cellula. Quindi, aggiungere 2 l di anticorpi antitag con etichetta PE (vedere la Tabella dei materiali) all’altro tubo di ogni tipo di cellula. Mescolare bene e incubarli sul ghiaccio per 30 min. Lavare le cellule con 3 mL di tampone FACS in ogni tubo e centrifugare i tubi a 300 x g per 5 min; scartare brevemente i supernatanti e il vortice o scuotere brevemente i tubi per risospendere brevemente le cellule nel liquido residuo. Aggiungete 2 -L di APC anti-CD3 e 2 -L di soluzione anticorpale 7-AAD (vedere la Tabella dei Materiali)ad ogni tubo. Nel tubo di cellule macchiate con anti-F(ab’)2 Ab, aggiungere 1 L di streptavidina con etichetta su PE. Mescolare brevemente e incubare i tubi sul ghiaccio per altri 30 min. Utilizzare il buffer FACS per lavare nuovamente le cellule come descritto al passaggio 3.5 e aggiungere altri 200 buffer FACS a ciascun tubo. Utilizzare la citometria di flusso per analizzare le celle prima gating sulle cellule T in un grafico a dispersione in avanti vs dispersione laterale e quindi gating sulle cellule vive (7-AAD-negativo) in un grafico CD3 vs 7-AAD. Il passo finale è quello di analizzare anti-tag, anti-ScFv o anti-F(ab’)2 contro CD3. 4. Saggio di potenza della citolisi in tempo reale NOTA: eseguire il saggio RTCA in base alle condizioni consigliate dal produttore. In breve, prima piastra le cellule bersaglio nei pozzetti della E-Plate, seguita dall’aggiunta di cellule CAR T il giorno successivo. L’attività di citolisi delle cellule T CAR contro le cellule bersaglio viene monitorata in tempo reale. Le cellule T e le cellule T tradotte in modo fittizio (cellule T carina) vengono utilizzate come controlli negativi delle cellule effacenti. Il seguente protocollo descrive un sugo di potenza di citolisi in vitro in tempo reale per le linee cellulari tumorali aderenti. Aggiungere 100 ll di mezzo di coltura cellulare di destinazione a ogni pozzo della XCELLigence E-Plate, posizionare la piastra all’interno dello strumento xCELLigence e prendere una lettura di sfondo. Quindi, trasferire l’E-Plate in una cappa di coltura dei tessuti per la semina cellulare. Utilizzare un protocollo standard per provare le cellule tumorali bersaglio dal dispositivo di coltura. Trasferire quindi le cellule in un tubo di centrifuga di 15 mL e aggiungere un nuovo mezzo di coltura, fino a 15 mL. Pellet le cellule per centrifugazione per 5 min a 200 x g. Scartare il supernatante, aggiungere 5 mL di mezzo fresco e utilizzare una pipetta sierologica per risospendere delicatamente il pellet cellulare. Contare la densità delle cellule vive utilizzando un emocitometro e un microscopio. Regolare la densità della cella in modo appropriato e quindi aggiungere 100 L della sospensione cellulare a ogni pozzetto della Piastra E. Il numero di cellule di destinazione è in genere di circa 10.000 cellule/pozzo per le linee cellulari aderenti (BxPC3, Hela-CD19 e SKOV3), o 30.000 cellule/pozzo per le cellule di sospensione come Raji (vedi sotto per i dettagli riguardanti i pozzi di precoating con anticorpi al fine di legare le cellule tumorali liquide). E-Plate a temperatura ambiente per 30 min per consentire alle cellule di depositarsi uniformemente sul fondo del pozzo (questo è fondamentale; non saltare questo passaggio). Posizionare l’E-Plate nello strumento xCELLigence all’interno dell’incubatore di coltura cellulare e iniziare a misurare l’impedimento, visualizzato come indice cellulare rispetto al tempo, automaticamente ogni 15 min. Il giorno dopo, preparare le cellule T dell’ereditore CAR. Assicurarsi di preparare i controlli appropriati (ad esempio, cellule T Car Car, cellule T di controllo non trasdotte e/o cellule CAR T non correlate) in anticipo per garantire che tutte le cellule siano pronte contemporaneamente. Regolare le cellule eferrorotrici e le celle di controllo alla densità corretta e preparare le diluizioni seriali per garantire che i rapporti E:T desiderati vengano raggiunti quando si aggiungerà 100 l di sospensione cellulare efentità a ciascuno bene nel passaggio 9. Metti in pausa l’acquisizione dei dati xCELLigence e porta l’E-Plate dall’incubatrice a una cappa di coltura cellulare. Togliere 100 l di mezzo da ogni pozzo. La quantità di mezzo residuo in ogni pozzo è ora di 100 L. Aggiungete 100 l di cellule T CAR con effettore diluite in serie o altre celle di controllo (ad esempio cellule Mock CAR T) per ottenere i rapporti E:T desiderati. Rimettere l’E-Plate a temperatura ambiente per 30 min per consentire alle cellule echetarie di depositarsi, quindi riporre l’E-Plate nello strumento xCELLigence. Riprendere l’acquisizione dei dati. Se lo si desidera, nei punti chiave xCELLigence l’acquisizione dei dati può essere messa in pausa e la piastra rimossa per raccogliere piccoli campioni da analizzare mediante saggi ortogonali (cioè misurare la produzione di citochine da eLISA o la citometria di flusso). Nell’esperimento EGFR-GITR-CD3 CAR T-cell, misurare la resa INF con un kit ELISA (seguire le istruzioni del produttore; vedere la Tabella dei Materiali).NOTA PER L’USO DI LIQUID CANCERS: Per testare le cellule tumorali ematologiche non aderenti, prima di aggiungere le cellule i pozze dell’E-Plate vengono prima rivestiti con un anticorpo specifico per un antigene che si esprime sulla superficie delle cellule tumorali. Per la linea cellulare Raji B viene utilizzato un reagente di tethering basato su anti-CD40 (vedi kit di analisi per l’uccisione del tumore liquido nella tabella dei materiali). Di seguito è riportata la procedura per il rivestimento della piastra: Diluire il reagente di tethering (anti-CD40) con il tampone di tethering ad una concentrazione di 4 g/mL. Lavorando all’interno di una cappa di coltura tissutale, aggiungere 50 l del reagente di tethering diluito ad ogni pozzo della E-Plate. Lasciare l’E-Plate a temperatura ambiente o in un’incubatrice di 37 gradi centigradi per 3 h. Rimuovere il reagente di tethering e lavare l’E-Plate almeno 2x con tampone di lavaggio. A questo punto, l’E-Plate è pronto per il semina delle cellule bersaglio Raji (30.000 cellule/pozzo). Continuare con il passaggio 4.1 (sopra) per eseguire il resto della procedura.

Representative Results

Preparazione del lentivirus CAR e valutazione della generazione e potenza delle cellule T CARI dispositivi di preparazione dei lentivirus CAR sono stati determinati utilizzando un kit quantitativo RT-PCR (vedi la tabella dei materiali)secondo il protocollo del produttore. Il protocollo di titolazione ha estratto prima l’RNA del virus e poi ha misurato il numero di copia dell’RNA lentivirale, che indicava la quantità di particelle virali infettive. Il titolo del virus generato da un piatto da 150 mm utilizzando il protocollo di cui sopra di solito varia tra 109-1010 10 copie virali/mL. Figura 2A mostra il numero di ciclo RT-PCR rispetto alla potenza del segnale da un risultato PCR quantitativo rappresentativo. Una volta che la qualità del virus è stata soddisfatta, quando il tigre era più grande di 1 x 108 pfu/mL, è stato congelato per la successiva trasduzione delle cellule T. Dopo che le cellule T CAR sono state tradurine con lentivirus, le cellule T sono state coltivate per altri 12-14 giorni, mantenendo la loro densità intorno 1 x 106 a 2 x 106 cellule / mL. Le cellule CAR T sono state poi controllate con anticorpi anti-ScFv-specifici utilizzando un citometro di flusso prima di un’applicazione a valle o congelare. Un buon risultato di batch rappresentativo è illustrato nella Figura 2B. Utilizzando un anticorpo anti-ScFv, circa il 50% delle cellule T CAR macchiate positive (Q2 50,6% contro cellule T 1%), indicando l’espressione di CAR in circa il 50% delle cellule T. Successivamente, il test di potenza della RTCA è stato eseguito per la determinazione della citolisi prima che ogni lotto di cellule T CAR fosse congelato e pronto per l’applicazione futura. Un ciclo della procedura di progettazione, generazione e valutazione delle cellule T CAR ha richiesto circa 1 mese. Uccisione di cellule del linfoma B Raji da cellule T CD22-CARIl kit di tethering del tumore liquido anti-CD40 (vedi Tabella dei Materiali)è stato utilizzato ad una concentrazione di 4 g/mL per rivestire una E-Plate per 3 h a 37 . Dopo aver lavato i pozzi con tampone di tethering, le cellule del linfoma a cellule B sono state aggiunte alla piastra E ad una densità di 30.000 cellule/pozzo. Dopo aver permesso alle cellule di accontentarsi di 30 min, l’E-Plate è stato rimesso all’interno dello strumento xCELLigence, e le letture di impedimento sono state immediatamente avviate al fine di catturare l’attaccamento e la proliferazione delle cellule. Il giorno seguente, sono state aggiunte cellule T CD22-CAR, cellule T di Mock CAR o cellule T non traduttrici. Nella Figura 3è stato utilizzato un rapporto E:T di 10:1 per tutti i tipi di cella. Le cellule Raji CD22-positive, trattate con cellule T CD22-CAR, hanno mostrato un’uccisione significativa (traccia verde) rispetto ai controlli negativi (cellule T non trastradotte e cellule T di Mock CAR). Uccisione efficace delle cellule tumorali del pancreas da parte delle cellule T CD47-CARCD47 è una proteina trasmembrana della superfamiglia dell’immunoglobulina. Come proteina associata all’integrino, è altamente espressa sia nei tumori ematologici (leucemia, linfoma, e mieloma multiplo) che nei tumori solidi (come ovarico, cancro del polmone a piccole cellule, pancreastico, glioblastoma) e altri tipi di tumori36,37. CD47 è anche conosciuto come un segnale non-mangiare-me ai macrofagi, che lo ha reso un potenziale bersaglio terapeutico in alcuni tumori. Le cellule T CD47-CAR sono state prodotte e testate contro le cellule tumorali pancreatiche BxPC3 che esprimono alti livelli di CD4738,39. Le cellule BxPC3 sono state semiate nella placca E il giorno 1 ad una densità di 10.000 cellule/pozzo. Il monitoraggio in tempo reale ha mostrato che queste cellule hanno raggiunto la confluenza dopo 16 h. A questo punto, le celle CAR T sono state aggiunte al rapporto E:T di 10:1 (Figura 4A). Sono state aggiunte anche cellule efcome effetto di controllo come cellule T non tradotte e cellule T Dimock CAR. I risultati mostrano chiaramente che le cellule T CD47-CAR uccidono selettivamente le cellule BxPC3 di destinazione29. Inoltre, la figura 4B mostra che il segnale di impediva quando le cellule T CD47-CAR vengono aggiunte a un pozzo vuoto è sostanzialmente inferiore al segnale di impedizione generato dalle cellule BxPC3 di destinazione. Il valore dell’indice di cella dei soli pozzi con cellule T CD47-CAR ha raggiunto un massimo di 0,14, che è solo leggermente superiore al segnale del solo mezzo (0,02). Ciò indica che in questo test di uccisione eterogeneo, il segnale di impedimento è derivato quasi esclusivamente dalle cellule tumorali bersaglio. Costimolazione delle cellule CAR T da parte del dominio GITRQuando è stato espresso in un’RCA EGFR-GITR-CD3, il dominio costimulatorio GITR è stato precedentemente segnalato per migliorare l’uccisione delle cellule tumorali EGFR-positive SKOV3, ma non le cellule tumorali di MCF-7 -negative30. Per chiarire meglio il ruolo del dominio GITR, i costrutti CAR contenenti il dominio GITR a lunghezza intera, o versioni eliminate o riorganizzate del dominio, sono stati generati e testati per la capacità di coattivare le cellule CAR T (Figura 5A). I dati xCELLigence in Figura 5B,C mostra che il dominio costimulatorio GITR migliora l’uccisione di cellule CAR T di cellule eGFR-positivo cellule sopra quello che viene osservato con il costrutto CAR originale che manca il dominio GITR. Inoltre, l’eliminazione di 10 aminoacidi dal dominio GITR (aminoacidi 184-193) ha abolito questa attività stimolatoria. Al contrario, riorganizzare il posizionamento relativo del dominio GITR all’interno del costrutto CAR si è rivelato meno dannoso per le sue capacità stimolanti. Utilizzando i dati dell’estremità, la produzione di IFN z come surrogato dell’attivazione delle cellule T ha dimostrato anche l’attività stimolatoria del dominio GITR (Figura 5B). A differenza dei dati del punto finale che è un mero “snap shot”, il profilo di impedenza continua dello strumento xCELLigence illumina chiaramente sottili differenze nella cinetica uccisione dei diversi trattamenti (Figura 5C). I risultati ottenuti qui sono coerenti con quelli di uno studio in vivo30. Figura 1: Il sistema di analisi delle cellule in tempo reale (RTCA) xCELLigence rileva l’uccisione di cellule bersaglio da parte delle cellule efseche. Ci sono tre principali fasi concettuali per misurare l’attività di uccisione delle cellule echeggiatrici CAR T contro le cellule tumorali bersaglio. Fase 1: Semina le cellule bersaglio (cioè le cellule tumorali) nel pozzo di una E-Plate. Le cellule si attaccano ai microelettrodi biosensori d’oro e questo impedisce il flusso di corrente elettrica tra gli elettrodi. Questo valore di impedimento viene misurato e tracciato come parametro senza unità denominato Indice di cella. Il valore di Indice Cellulare aumenta man mano che le cellule crescono e raggiunge un altopiano quando le cellule si avvicinano alla confluenza. Fase 2: Successivamente vengono aggiunte cellule immunitarie effettore non aderenti. Poiché queste cellule non aderiscono ai microelettrodi d’oro, non causano direttamente un cambiamento impedibile. Passo 3: Se le cellule efcomeci attaccano le cellule tumorali bersaglio, la distruzione delle cellule tumorali è riflessa da una diminuzione dell’indice cellulare nel tempo. Questa attività citolitica delle cellule eftraitrici, o la potenza delle cellule efeticatrici, può essere monitorata in modo sensibile e preciso. L’acquisizione continua di dati impedibili dal sistema xCELLigence consente l’analisi cinetica di uccisione in tempo reale per più condizioni contemporaneamente. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 2: Determinazione titer del lentivirus e valutazione della citometria di flusso delle cellule T CAR. (A)Determinazione del titro lentivirale. Le diverse linee di colore sono campioni rappresentativi per il numero di ciclo rispetto a delta Rn. I numeri di ciclo bassi indicano una quantità relativamente elevata di modello di RNA di virus presente nei campioni. (B) Dopo la trasduzione, le cellule CAR T sono state coltivate e mantenute ad una densità inferiore a 2 x 106 cellule/mL e quindi sottoposte ad analisi del flusso. L’asse yriflette la colorazione per le celle T, con valori positivi riflessi nelle aree T1 e T2. Entrambi i campioni sono 100% positivi per le cellule T. L’espressione di CAR scFV viene determinata utilizzando un Ab (assex)specifico di scFv. Il risultato mostra che più del 50% delle cellule T sono scFv positive nelle cellule T CD22-CAR. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 3: Dinamica di uccisione delle cellule T CD22-CAR contro le cellule del linfoma di Raji Burkitt. Mentre la curva rossa è la sola cella Raji, la curva verde è la cella Raji trattata con cellule T CD22-CAR. Le curve rosa e blu sono rispettivamente il trattamento con cellule T Mock CAR e il trattamento con cellule T non tradotte. Il rapporto E:T è 10:1. Le barre di errore sono una deviazione standard. La scala cronologica è impostata a intervalli di 2 h per una facile visualizzazione, anche se sono disponibili più punti dati. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 4: Efficacia delle cellule T CD47-CAR contro le cellule tumorali solide pancreatiche. (A) Il rosa è la sola cella BxPC3 di destinazione, mentre il rosso è BxPC3 con le cellule T CD47-CAR aggiunte. Il verde è BxPC3 con l’aggiunta di cellule T non tradotte, e il blu è con cellule T Mock CAR. Il rapporto E:T è 10:1. (B) Nello stesso contesto, il rosso è vuoto (senza celle bersaglio) controlla i pozzi solo con celle T CD47-CAR e il verde è solo il mezzo. Le barre di errore sono una deviazione standard. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 5: dominio GITR aumenta L’attività citotossico cellule T CAR contro le linee cellulari tumorali EGFR-positivo. (A) Costrutti CAR diversi. (B) Grafici a barre di % citolisi per diversi costrutti CAR a 4 h (sinistra) e 24 h (al centro). La produzione dell’IFN è a 24 ore a destra. (C) Valutazione continua delle uccisioni per tutti i costrutti. La curva nera è solo la curva di crescita delle cellule tumorali ovariche BxPC3. La curva verde è la cella bersaglio trattata solo con cellule T, la curva blu è la cella bersaglio trattata con cellule T di Mock CAR, la curva rossa è la cella bersaglio trattata con cellule T EGFR-GITR-CD3-CAR, la curva rosa è la cella bersaglio trattata con cellule EGFR-GIT-CD3-CAR T e la curva marrone è la cella bersaglio trattata con cellule EGFR-CD3-GITR-CAR T. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

I recettori degli antigeni chimerierici sono proteine multidominio composte da un frammento extracellulare di variabili a catena singola (regione scFv), una regione cerniera, una regione transmembrana e un dominio citoplasmico composto da domini di segnalazione TCR e domini cosstimulatori aggiuntivi da recettori come CD28 e OX4011,40. Per progettare CAR sicuri, selettivi ed efficaci, è imperativo che le varie permutazioni nella progettazione dei CAT siano accuratamente testate utilizzando analisi in vitro e, infine, modelli animali. In questo studio, abbiamo fornito un protocollo e un flusso di lavoro per il modo in cui un analisi della potenza in vitro in tempo reale può informare la progettazione di CAT efficaci.

Nella progettazione di qualsiasi tipo di analisi di potenza, in particolare per scopi di produzione, è imperativo che il saggio sia sensibile, robusto, coerente e il più vicino possibile al meccanismo d’azione16,17,41. L’esempio di potenza in tempo reale descritto qui è progettato per misurare direttamente l’attività citolytica della cellula CAR T piuttosto che utilizzare un marcatore surrogato come il rilascio di citochine. È importante sottolineare che il saggio non richiede componenti aggiuntivi come coloranti o reagenti diversi dalla piastra di qualità (E-Plate) e dal supporto consigliato per la manutenzione delle cellule. Inoltre, il saggio è squisitamente sensibile e fornisce dati altamente riproducibili rispetto ad altri saggi basati su etichette42,43,44. Inoltre, il saggio xCELLigence è suscettibile di utilizzare rapporti effetto-bersaglio molto bassi, che è ideale per la valutazione di una citolisi specifica.

Al fine di dimostrare la flessibilità e l’utilità del sistema xCELLigence, ci siamo concentrati su due tipi di tumore, vale a dire tumori di origine ematologica e tumori solidi. Per valutare la potenza delle cellule CAR T, le cellule CAR T, dirette da CD22, le cellule Raji (cioè una linea di cellule del linfoma a cellule B) sono state legate alle piastre E utilizzando un anticorpo anti-CD40. Il tethering delle cellule Raji sul fondo delle piastre E si traduce in un segnale di impedimento che riflette la vitalità e il numero di cellule Raji nel pozzo. Dopo l’aggiunta di cellule T CD22-CAR, le cellule Raji vengono uccise in modo selettivo in modo dipendente dal tempo e dall’effettore, culminando in una diminuzione dipendente dal tempo nel segnale di impedimento. Il calo dell’impegliato significa citolisi o perdita di vitalità delle cellule Raji17. Questo approccio di tethering selettivo utilizzando anticorpi può essere esteso ad altre linee cellulari tumorali liquidi. Una strategia alternativa all’utilizzo di linee di cellule tumorali di origine ematologica consiste nell’utilizzare cellule tumorali aderenti che sono progettate per esprimere stabilmente gli antigeni tumorali, come CD19 espresso nelle cellule HeLa. Il vantaggio di questo approccio è che le cellule HeLa parentali sono prontamente disponibili e possono essere utilizzate come controllo negativo per la specificità. Tale approccio è già stato convalidato con cellule CHO-CD22 rispetto a CHO e CHO-BCMAs e cellule CHO29. Utilizzando approcci così diversi, la progettazione e l’efficacia delle cellule T CAR possono essere facilmente testate. Il saggio xCELLigence è intrinsecamente flessibile e le condizioni di analisi possono essere regolate al fine di approssimare al massimo le condizioni fisiologiche.

Uno dei principali vantaggi dell’analisi della potenza che abbiamo descritto qui è che si tratta di un semplice saggio funzionale e può essere utilizzato in combinazione con tecniche di ingegneria genetica per progettare CAR ottimali ed efficaci in modo ad alta produttività. Come è stato dimostrato qui per le cellule CAR T progettate per colpire le cellule tumorali positive EGFR, il test può essere utilizzato per valutare l’attività relativa di diversi costrutti/mutanti CAR. Ad esempio, abbiamo dimostrato che quando il dominio GITR si trova a monte del dominio CD3 mostra un’attività citolytica molto più robusta rispetto a quando si trova a valle del dominio CD3.

Anche se non è perfettamente correlato con l’attività cellulare CAR T in vivo, il rilascio di citochine in vitro è stato storicamente utilizzato come misura della potenza delle cellule CAR T. Anche se l’analisi di potenza basata su xCELLigence qui descritta può essere utilizzata per valutare terapie basate sulle cellule durante la produzione o prima di essere rilasciate per l’applicazione clinica, quanto bene questi risultati correlano con l’efficacia in vivo non è ancora stato Stabilito. L’efficacia in vivo dipende da una serie di fattori e variabili che non possono essere riassunti all’interno di un saggio in vitro. Tali variabili includono: homing delle cellule T CAR al sito del tumore, la stimolazione e l’attivazione della cellula T CAR e la sua capacità di persistere all’interno del paziente e il microambiente tumorale. Con un ulteriore perfezionamento il saggio xCELLigence può essere in grado di modellare alcuni di questi processi complessi in vitro.

Il protocollo qui fornito si applica alla maggior parte delle linee cellulari tumorali aderenti e ad alcune delle linee cellulari del tumore liquido. I campioni clinici come le cellule tumorali primarie, tuttavia, devono essere ulteriormente testati e ottimizzati a causa della complessità dei tipi e delle fasi tumorali. Vale certamente la pena notare che il sistema di analisi della potenza in vitro qui descritto utilizza linee cellulari tumorali solo per riflettere la potenziale attività delle cellule T CAR. La vera situazione tumorale all’interno del corpo umano è molto più complessa, soprattutto quando un tumore solido è mirato, a causa dell’ambiente tumorale dinamico e dello sviluppo. Pertanto, il risultato della valutazione della potenza potrebbe non tradursi molto bene nell’efficacia clinica delle cellule T CAR testate.

In sintesi, la piattaforma xCELLigence basata su impedimento presentata consente il monitoraggio senza etichette dell’uccisione cellulare per un lungo periodo di tempo, vale a dire fino a 10 giorni. Questa capacità per una scala temporale così lunga per la raccolta dei dati differenzia la tecnologia da altri saggi che sono attualmente in uso e che richiedono la creazione di più repliche sperimentali per la raccolta di punti temporali e la laboriosa manipolazione dei campioni. Inoltre, il contributo minimo del segnale delle cellule immunitarie dell’effettore semplifica l’analisi dei dati. Il software è in grado di elaborare i dati automaticamente e generare parametri utili come la percentuale di citolisi, KT50, ecc. La tecnologia ha già dimostrato un’elevata sensibilità (con rapporti E:T a partire da 1:20) e una vasta gamma dinamica (con rapporti E:T da 20:1 a 1:20), che non è facilmente raggiungibile con altri saggi. Nel complesso, l’implementazione di questa tecnologia dovrebbe consentire un’analisi dei dati più accurata su una scala di velocità effettiva più elevata che migliorerà lo sviluppo di reagenti a cellule T CAR, facendo avanzare il campo a un ritmo molto più elevato.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori ringraziano ProMab Biotechnologies e ACEA Biosciences per aver fornito i reagenti e gli strumenti utilizzati in questo studio.

Materials

7-AAD Biolegend 420404
Anti-CD40, liquid tumor killing assay kit ACEA Biosciences 8100005
anti-human F(ab')2 Jackson Immunoresearch laboratories. 109-116-088
APC anti-CD3 Biolegend 317318
Assay medium RPMI1640 life technologies.Corp 11875-093
CAR-T cell frozen solution CryostorCS10 Stemcell technologies #07930
CAR-T cell medium from ProMab AIM-V+300IFU/ml IL-2 12055-091
CD3/CD28 coated microbeads, Dynabeads Thermofisher 11131D
DMEM GElifesciences.com SH30243.02
FACS buffer Promab made
FBS Lonza.com 14-503F
HEK293FT Thermo Fisher R70007
INFg ELISA kit Thermo Fisher
Lentiviral Packaging Mix System Biosciences VP100
Lenti-X quantitative RT-PCR titration kit (Clontech) Takara 631235
Promab medium for target cells Varied with cell lines
Real time Cellular Analyer ACEA Biosciences
Thermal cycler Thermo Fisher
Transduction enhance agent, Virus Transduction Enhancer (Alstem) Transplus, Alstem V020
Transfection dilution solution, Opti-MEM Thermo Fisher
Transfection reagent, NanoFect reagent Alstem NF100
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Xi, B., Berahovich, R., Zhou, H., Xu, S., Wei, Y., Guan, J., Harto, H., Guan, J., Wu, L., Santa Ana, D., Cerignoil, F., Lamarche, B., Abassi, Y. A., Golubovskaya, V. A Real-time Potency Assay for Chimeric Antigen Receptor T Cells Targeting Solid and Hematological Cancer Cells. J. Vis. Exp. (153), e59033, doi:10.3791/59033 (2019).
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