Identificeren van celoppervlak markeringen van primaire neurale stam en voorlopercellen door metabole labeling van Sialoglycan

Neurale stamcellen worden gedefinieerd als een multipotente celpopulatie die zichzelf kan verlengen om een stamcel zwembad te behouden en zich te differentiëren in neuronen en gliacellen. Ze zijn de belangrijkste celtypen in het zenuwstelsel en kunnen een groot therapeutisch potentieel bieden in regeneratieve geneeskunde door middel van celtransplantatie in zieke en gewonde hersenen^1,2. Naarmate de ontwikkeling vordert, wordt de neurale stamcel populatie heterogene^3,4, en het aandeel van neurale stamcellen in de hersenen neemt geleidelijk af⁵. Over het algemeen bevinden embryonale stamcellen en andere neurale voorlopercellen, gezamenlijk neurale stam-en voorlopercellen (Nspc’s), zich in de Germinal zones, de ventriculaire zone en de subventriculaire zone bij muizen⁶. In het embryonale brein genereren neurale stamcellen direct of indirect neuronen via tussenliggende voorlopercellen (ipc’s), en in sommige soorten door de buitenste subventriculaire zone-voor ouders (orgs)^7,8. De specifieke moleculaire handtekening, morfologie, locatie in de stamcel niche en differentiatie potentieel bepalen allemaal de rol van elk subtype in hersen organogenese en klinische toepassingen⁹. De momenteel beschikbare celoppervlak markeringen kunnen echter niet ondubbelzinnig verschillende subtypen van Nspc’s discrimineren en zuiveren, waardoor het begrip en het gebruik van deze subtypen worden beperkt.

De identificatie van primaire NSPCs-oppervlak markeringen wordt beperkt door drie grote hindernissen. De eerste is het beperkte celnummer van Nspc’s in het weefsel, waardoor het moeilijk is om celoppervlakte proteïne monsters voor te bereiden voor gemeenschappelijke massaspectrometrie analyse. De tweede beperking is de moeilijkheid bij het produceren van zuivere celsubtypen voor het genereren van subtype-specifieke membraan proteïne gegevens. Ten slotte is de derde uitdaging de lage ratio van celoppervlakte eiwitten in hele celeiwitten, wat hun detectie gevoeligheden belemmert door massaspectrometrie analyse.

Om deze problemen te overwinnen, ontwikkelden we een chemoproteomische benadering om celoppervlakte eiwitten in primaire Nspc’s selectief te verrijken en te identificeren door de sialoglycoproteïnen¹⁰metabolisch te labelen. Om een voldoende aantal Nspc’s te genereren, maakten we gebruik van een vastgesteld protocol om de primaire embryonale Nabc’s in ongedifferentieerde toestanden uit te breiden en te handhaven in vitro, door het coculeren van Nspc’s met muizen hersen endotheliale cellijnen met behulp van een permeabele ondersteuning matrix insert (bijv. trans well) systeem¹¹. In tegenstelling, npscs gekweekt alleen zonder endotheel cellen genereren gedifferentieerde nageslacht^11,12. Zo kunnen eiwit monsters van deze twee kweeksystemen relatief worden geanalyseerd om eiwitten te identificeren die differentieel uitgedrukt zijn in Nspc’s en gedifferentieerde neuronen. Aangezien de meeste celoppervlakte eiwitten worden gemodificeerd door sialic acid¹³, onnatuurlijke sialic acid precursor analoge N-azidoacetylmannosamine-tetraacylated (AC₄Mannaz) werd gebruikt om de intrinsieke metabole route te kapen, zodat endogene, nieuw gesynthetiseerde sialoglycans zijn gelabeld met meer groepen, het genereren van een chemische handvat¹⁴. Via azido-alkyne-gemedieerde bioorthogonale reacties, die biotine aan sialoglycans Conjugeren, kunnen celoppervlakte eiwitten worden gevisualiseerd en verrijkt voor proteomische identificatie door middel van een streptavidine-gekoppelde de of matrix¹⁴.

Hier voeren we kleuring van SDS-PAGE gel analyse van het oppervlak sialoglycoproteome uit Nspc’s uitgebreid in een endotheliale co-cultuur en differentiërende cellen in een niet-co-cultuur systeem. We zuiveren ook selectief oppervlak sialoglycoproteome in de twee kweeksystemen voor proteomische vergelijking. Ons protocol, in vergelijking met de traditionele centrifugatie-based cel oppervlakte zuivering protocollen¹⁵, verhoogt de extractie werkzaamheid door het verminderen van de oppervlakte-EiwitExtractie procedures door middel van specifieke tag conjugatie en affiniteit Zuivering. Ondertussen, het verhoogt de extractie zuiverheid van celoppervlakte eiwitten op basis van de veronderstelling dat verminderde gebeurt meestal op het celoppervlak eiwitten. Hoewel endotheliale factoren de differentiatie van uitgebreide Nspc’s niet volledig kunnen blokkeren, biedt de vergelijkende studie tussen een co-cultuur en gedifferentieerde cultuur een handige methode om stamcel verrijkte oppervlakte eiwitten te lokaliseren zonder de noodzaak om Analyseer eiwitten uit Npc’s gezuiverd door FACS¹⁶. Wij zijn van mening dat deze aanpak kan worden toegepast op onderzoek van oppervlakte eiwitten in andere systemen met de juiste aanpassingen.