Определение клеточных поверхностных маркеров первичных нейронных стволовых и клеток-прародителей путем метаболической маркировки сиалогликан

Нейронные стволовые клетки определяются как многопотентная популяция клеток, которые могут самообновляться для поддержания пула стволовых клеток и дифференцироваться в нейроны и глию. Они являются основными типами клеток в нервной системе и может предложить большой терапевтический потенциал в регенеративной медицине через пересадку клеток в больные и поврежденные мозги^1,2. По мере развития популяция нервных стволовых клеток становится неоднородной^3,4,а доля нервных стволовых клеток в головном мозге постепенно уменьшается^{на 5.} Вообще говоря, эмбриональные нервные стволовые клетки и другие нервные клетки-прародители, коллективно называемые нервными стволовыми и клетками-потоменками (NSPCs), расположены в зародышевых зонах, желудочковой зоне и субвентрикулярной зоне у мышей^6. В эмбриональном мозге нервные стволовые клетки генерируют нейроны прямо или косвенно через промежуточные клетки-прародители (ИПК), а у некоторых видов через внешние субжелудочковые зоны прародителей (ОРГ)^7,8. Специфическая молекулярная подпись, морфология, расположение в нише стволовых клеток и потенциал дифференциации определяют роль каждого подтипа в органогенезе мозга и клинических приложениях^9. Однако имеющиеся в настоящее время маркеры поверхности клеток не могут однозначно дискриминировать и очищать различные подтипы NSPCs, ограничивая понимание и использование этих подтипов.

Идентификация первичных поверхностных маркеров NSPCs ограничена тремя основными препятствиями. Первый из них является ограниченное количество клеток NSPCs в ткани, что затрудняет подготовку образцов клеточного белка поверхности для общего анализа масс-спектрометрии. Вторым ограничением является трудность в производстве чистых подтипов клеток для генерации подтип-специфических данных мембранного белка. Наконец, третьей проблемой является низкое соотношение белков поверхности клеток в целых белках клеток, что затрудняет их чувствительность обнаружения с помощью анализа масс-спектрометрии.

Чтобы преодолеть эти проблемы, мы разработали химиопротеомный подход к выборочноо обогащать и идентифицировать белки поверхности клеток в первичных NSPCs путем метаболически маркировки sialoglycoproteins¹⁰. Для создания достаточного количества NSPCs, мы воспользовались установленным протоколом для расширения и поддержания первичных эмбриональных NSPCs в недифференцированных состояниях in vitro, путем совместного культивирования NSPCs с мышью мозга эндотелиальных клеточных линий с использованием проницаемой поддержки матричная вставка(например, трансвелл) система¹¹. В отличие от этого, NPSCs культивируется в одиночку без эндотелиальных клеток генерировать дифференцированное потомство^11,12. Таким образом, образцы белков из этих двух систем культуры могут быть сравнительно проанализированы для выявления белков, которые дифференцированно выражены в NSPCs и дифференцированных нейронов. Поскольку большинство белков поверхности клеток модифицируются сиалевой кислотой¹³, неестественный сиалевой кислоты предшественник аналог N-азидоацетилманнозамин-тетраацилат (Ac₄ManNAz) был использован для захвата внутренней метаболической пути так, что эндогенные, вновь синтезированные sialoglycans помечены группами азидо, генерации химической ручкой¹⁴. Через азидо-алкино-опосредованные биоортогональные реакции, которые спрягают биотин с силогликанами, белки поверхности клеток могут быть визуализированы и обогащены для протеомальной идентификации с помощью стрептавидидного фторофора или матрицы^14.

Здесь мы выполняем анализ геля SDS-PAGE поверхности сиологликопротеома из NSPCs, расширенного в эндотелиальной кокультуры и дифференциирующих ячеек в не-кокультурной системе. Мы также избирательно очищаем поверхность силогликопеома в двух культурных системах для протеомического сравнения. Наш протокол, по сравнению с традиционными центрифугина на основе протоколов очистки поверхности клеток¹⁵, повышает эффективность экстракции за счет сокращения процедур экстракции поверхностного белка через конкретные спряжения тегов и сродство Очистки. Между тем, это увеличивает чистоту извлечения белков поверхности клеток на основе предпосылки, что сиилиляция происходит в основном на поверхности клеток белков. Хотя эндотелиальные факторы не могут полностью блокировать дифференциацию расширенных NSPCs, сравнительное исследование между совместной культурой и дифференцированной культурой обеспечивает удобный метод определения обогащенных стволовыми клетками поверхностных белков без необходимости анализировать белки из NPCs, очищенных FACS¹⁶. Мы считаем, что этот подход может быть применен к исследованиям поверхностных белков в других системах с соответствующими изменениями.