Identificando marcadores de superfície celular da haste neural primária e células progenitoras por rotulagem metabólica de Sialoglycan

Células-tronco neurais são definidas como uma população de células multipotentes que podem se autorenovar para manter uma piscina de células-tronco e diferenciar-se em neurônios e glia. Eles são os principais tipos de células no sistema nervoso e podem oferecer grande potencial terapêutico na medicina regenerativa através da transplantação celular em cérebros doentes e feridos^1,2. Como o desenvolvimento^{prossegue, a}população de células-tronco neural torna-se heterogênea^{3,4, e}a proporção de células-tronco neurais no cérebro diminui gradualmente⁵. De modo geral, células-tronco neurais embrionárias e outras células progenitoras neurais, denominadas coletivamente de tronco neural e células progenitoras (nspcs), estão localizadas nas zonas germinais, na zona ventricular e na zona zona em camundongos⁶. No cérebro embrionário, as células-tronco neurais geram neurônios direta ou indiretamente através de células progenitoras intermediárias (ipcs), e em algumas espécies através dos progenitores da zona zona externa (orgs)^7,8. A assinatura molecular específica, a morfologia, a localização no nicho de células-tronco e o potencial de diferenciação determinam o papel de cada subtipo na organogênese cerebral e nas aplicações clínicas⁹. No entanto, os marcadores de superfície de célula atualmente disponíveis não podem discriminar inequivocamente e purificar diferentes subtipos de NSPCs, limitando a compreensão e a utilização desses subtipos.

A identificação de marcadores de superfície primários de NSPCs é limitada por três grandes obstáculos. O primeiro é o número limitado de células NSPCs no tecido, dificultando a preparação de amostras de proteínas de superfície celular para análise de espectrometria de massas comum. A segunda limitação é a dificuldade na produção de subtipos de células puras para a geração de dados de proteínas de membrana subtipo-específicos. Finalmente, o terceiro desafio é a baixa proporção de proteínas de superfície celular em proteínas de células inteiras, o que dificulta suas sensibilidades de detecção por espectrometria de massas.

Para superar estes problemas, nós desenvolvemos uma aproximação chemoproteomic para enriquecer seletivamente e identificar proteínas de superfície da pilha em nspcs preliminares pela rotulagem metabolicamente as sialoglycoproteínas¹⁰. Para gerar um número suficiente de NSPCs, aproveitamos um protocolo estabelecido para expandir e manter NSPCs embrionários primários em Estados indiferenciados in vitro, por coculturando NSPCs com linhas celulares endoteliais cerebrais do camundongo usando um suporte permeável sistema de inserção da matriz (por exemplo, transwell)¹¹. Em contrapartida, as npscs cultivadas isoladamente sem células endoteliais geram Progênese diferenciada^11,12. Assim, amostras de proteínas desses dois sistemas de cultura podem ser analisadas comparativamente para identificar proteínas diferencialmente expressas em NSPCs e neurônios diferenciados. Como a maioria das proteínas de superfície celular são modificadas por ácido siálico¹³, não natural ácido siálico precursor analógico N-azidoacetilmannosamina-tetraacylated (AC₄Mannaz) foi usado para seqüestrar a via metabólica intrínseca de modo que endógena, recém- sialoglicanos sintetizados são marcados com grupos azido, gerando um punho químico¹⁴. Com as reações do azido-alkyne-negociadas, que conjugar a biotina aos sialoglycans, as proteínas de superfície da pilha podem ser visualizadas e enriquecidas para a identificação proteômica com um fluoróforo streptavidin-acoplado ou uma matriz¹⁴.

Aqui, nós realizamos a mancha da análise do gel de SDS-PAGE do sialoglycoproteome de superfície dos NSPCs expandidos em uma cocultura endotelial e em pilhas diferenciando-se em um sistema da não-cocultura. Nós igualmente seletivamente purificar o sialoglycoproteome de superfície nos dois sistemas da cultura para a comparação proteômica. Nosso protocolo, comparado com os protocolos tradicionais da purificação de superfície da pilha da centrifugação-baseada¹⁵, aumenta a eficácia da extração reduzindo os procedimentos de extração da proteína de superfície com a conjugação e a afinidade específicas do Tag Purificação. Entretanto, aumenta a pureza da extração de proteínas de superfície da pilha baseadas na premissa que o sialylation acontece na maior parte nas proteínas de superfície da pilha. Embora os fatores endothelial não possam completamente obstruir a diferenciação de NSPCs expandidos, o estudo comparativo entre uma cocultura e uma cultura diferenciada fornece um método conveniente para identificar proteínas de superfície pilha-enriquecidas da haste sem a necessidade de analisar proteínas de NPCs purificadas por FACS¹⁶. Acreditamos que essa abordagem pode ser aplicada a estudos de proteínas superficiais em outros sistemas com as modificações apropriadas.