シアログリカンの代謝標識による原発神経幹および前駆細胞の細胞表面マーカーの同定

神経幹細胞は、幹細胞プールを維持し、ニューロンとグリアに分化するために自己更新することができる多能性細胞集団として定義されています。それらは神経系の主要な細胞型であり、病気および傷ついた脳への細胞移植を通じて再生医療に大きな治療の可能性を提供^{するかもしれない1、2。}発達が進むにつれて、神経幹細胞集団は異^種3、4となり、脳内の神経幹細胞の割合は徐々に5に^{減少する。}一般的に言えば、胚性神経幹細胞および他の神経前駆細胞は、総称して神経幹および前駆細胞(NSPC)と呼ばれ、^マウス6の胚ゾーン、心室ゾーン、および心室下ゾーンに位置する。胚性脳では、神経幹細胞は中間前駆細胞(IPC)を介して直接的または間接的にニューロンを生成し、一部の種では外室ゾーン前駆体(oRGs)7、8を介して生成する。特定の分子シグネチャ、形態、幹細胞ニッチにおける位置、および分化電位はすべて、脳器形成および臨床応用における各サブタイプの役割を決定^する9。ただし、現在利用可能なセル サーフェス マーカーは、異なるサブタイプの NSPC を明確に区別および浄化することはできず、これらのサブタイプの理解と使用率を制限します。

プライマリ NSPC サーフェス マーカーの識別は、3 つの主要なハードルによって制限されます。1つ目は組織内のNCSPCの細胞数が限られているため、一般的な質量分析分析用の細胞表面タンパク質サンプルの調製が困難です。第2の制限は、サブタイプ特異的な膜タンパク質データを生成するための純粋な細胞サブタイプを生成する難しさです。最後に、第3の課題は、全細胞タンパク質中の細胞表面タンパク質の低比率であり、質量分析による検出感度を阻害します。

これらの問題を克服するために、シアロジリコタンパク^質10を代謝的に標識することにより、一次NSPCにおける細胞表面タンパク質を選択的に濃縮し同定する化学タンパク質アプローチを開発した。十分な数のNSPCを生成するために、我々は、透過性支持体を使用してマウス脳内皮細胞株とNSPCを共培養することにより、インビトロの未分化状態における原発性胚性NSPCを拡張および維持するために確立されたプロトコルを利用した。マトリックスインサート(例えば、トランスウェル)^{システム11.}対照的に、NPSCは内皮細胞を持たずに単独で培養し、分化した^{子孫11、12}を生成する。したがって、これら2つの培養システムからのタンパク質サンプルを比較分析して、NCPCと分化ニューロンで分別的に発現するタンパク質を同定することができる。ほとんどの細胞表面タンパク質は、シアル^酸13によって修飾されているように、非天然シアル酸前駆体アナログN-アジドアセチルマンノサミン-四面体化(Ac₄ManNAz)は、内因性、新たに内因性を持つ固有の代謝経路をハイジャックするために使用された合成されたシアログリカンは、アジド基で標識され、化学^{ハンドル14}を生成する。シオチンをシアロジカンに結合させるアジドアルキン媒介性バイオオルトゴン反応を通じて、細胞表面タンパク質は、ストレプトアビジン結合フッ素または^{マトリックス14}を介してプロテオミクス同定のために可視化および濃縮することができる。

ここでは、非共培養系における内皮共培養および分化細胞において拡大したNCから表面シアログリコプロテオームのSDS-PAGEゲル解析の染色を行う。我々はまた、プロテオミック比較のための2つの培養系における表面シアロジコプロテオームを選択的に精製する。当社のプロトコルは、従来の遠心分離ベースの細胞表面浄化^{プロトコル15}と比較して、特定のタグ結合と親和性を介して表面タンパク質抽出手順を減らすことによって抽出の有効性を高めます。浄化。一方、シアルリル化は主に細胞表面タンパク質で起こることを前提に、細胞表面タンパク質の抽出純度を高めます。内皮因子は拡大されたNSPCの分化を完全に妨げることはできませんが、共培養と分化培養との比較研究は、幹細胞を含有する表面タンパク質を必要とせずに特定する便利な方法を提供します。FACS¹⁶によって精製されたNPCからのタンパク質を分析する。このアプローチは、適切な改変を伴う他のシステムにおける表面タンパク質の研究に応用できると考えています。