Identification des marqueurs de surface cellulaire des cellules neurales primaires de tige et de progéniture par l'étiquetage métabolique du sialoglycan

Les cellules souches neurales sont définies comme une population de cellules multipotentes qui peut se renouveler pour maintenir une piscine de cellules souches et se différencier en neurones et en gliales. Ils sont les principaux types de cellules dans le système nerveux et peuvent offrir un grand potentiel thérapeutique en médecine régénérative par la transplantation cellulaire dans les cerveaux malades et blessés^1,2. Au fur et à mesure que le développement se poursuit, la population de cellules souches neurales devient hétérogène^3,4, et la proportion de cellules souches neurales dans le cerveau diminue progressivement⁵. D’une manière générale, les cellules souches neurales embryonnaires et d’autres cellules progénitrices neurales, appelées cellules souches et progénitrices neurales (NSPC), sont situées dans les zones germinales, la zone ventriculaire et la zone sous-ventriculaire chez la souris⁶. Dans le cerveau embryonnaire, les cellules souches neurales génèrent des neurones directement ou indirectement par l’intermédiaire des cellules progénitrices intermédiaires (CIP), et chez certaines espèces par l’intermédiaire des progéniteurs de zone sous-ventriculaire externe (ORG)^7,8. La signature moléculaire spécifique, la morphologie, l’emplacement dans la niche de cellules souches, et le potentiel de différenciation déterminent tous le rôle de chaque sous-type dans l’organogenèse du cerveau et les applications cliniques⁹. Cependant, les marqueurs de surface cellulaire actuellement disponibles ne peuvent pas discriminer et purifier sans équivoque différents sous-types de NSPC, limitant la compréhension et l’utilisation de ces sous-types.

L’identification des marqueurs de surface primaires des NSPC est limitée par trois obstacles majeurs. Le premier est le nombre limité de cellules de NSPcC dans le tissu, ce qui rend difficile la préparation d’échantillons de protéines de surface cellulaire pour l’analyse de spectrométrie de masse commune. La deuxième limitation est la difficulté à produire des sous-types de cellules pures pour générer des données de protéines membranaires spécifiques au sous-type. Enfin, le troisième défi est le faible rapport des protéines de surface cellulaire dans les protéines cellulaires entières, ce qui entrave leur sensibilité de détection par l’analyse de spectrométrie de masse.

Pour surmonter ces problèmes, nous avons développé une approche chimioprotéomique pour enrichir sélectivement et identifier les protéines de surface cellulaire dans les NSPC primaires en étiquetant métaboliquement les sialoglycoprotéines¹⁰. Pour générer un nombre suffisant de NSPC, nous avons profité d’un protocole établi pour étendre et maintenir les NSPC embryonnaires primaires dans des états indifférenciés in vitro, en co-ccultant des NSPc avec des lignées de cellules endothéliales de cerveau de souris utilisant un support perméable insert de matrice(par exemple, transwell) système¹¹. En revanche, les NPSC cultivés seuls sans cellules endothéliales génèrent la progéniture différenciée^11,12. Ainsi, les échantillons de protéines de ces deux systèmes de culture peuvent être analysés comparativement pour identifier les protéines qui sont exprimées différemment dans les NSPC et les neurones différenciés. Comme la plupart des protéines de surface cellulaire sont modifiées par l’acide sialique¹³, précurseur sialique contre nature précurseur analogique N-azidoacetylmannosamine-tétraacylated (Ac₄ManNAz) a été utilisé pour détourner la voie métabolique intrinsèque de sorte que endogène, nouvellement les sialoglycas synthétisés sont étiquetés avec des groupes d’azido, générant une poignée chimique¹⁴. Grâce à des réactions bioorthogonal salkyne-négociées par azido, qui conjuguent la biotine aux sialoglycans, les protéines de surface cellulaire peuvent être visualisées et enrichies pour l’identification protéomique par un fluorophore couplé à la streptavidine ou une matrice^14.

Ici, nous effectuons la coloration de l’analyse de gel SDS-PAGE du sialoglycoproteome de surface des NSPC étendus dans une co-culture endothéliale et des cellules différenciantes dans un système de non-co-culture. Nous purifions également sélectivement le sialoglycoproteome de surface dans les deux systèmes de culture pour la comparaison protéomique. Notre protocole, comparé aux protocoles traditionnels de purification de surface cellulaire basé sur la centrifugation¹⁵, augmente l’efficacité d’extraction en réduisant les procédures d’extraction de protéine de surface par la conjugaison et l’affinité spécifiques d’étiquette purification. Pendant ce temps, il augmente la pureté d’extraction des protéines de surface cellulaire basée sur la prémisse que la sialylation se produit principalement aux protéines de surface cellulaire. Bien que les facteurs endothéliaux ne puissent pas bloquer complètement la différenciation des NSPC élargis, l’étude comparative entre une co-culture et une culture différenciée fournit une méthode pratique pour identifier les protéines de surface enrichies en cellules souches sans avoir besoin de analyser les protéines des PNJ purifiées par FACS¹⁶. Nous croyons que cette approche peut être appliquée aux études des protéines de surface dans d’autres systèmes avec les modifications appropriées.